ИСТИНА

Практически все эффективные противораковые средства направлены на инициирование апоптоза в клетках. Однако применение химических препаратов, вызывающих апоптоз, по большей части оказывается эффективным только вначале, а затем опухоль вырабатывает способность противостоять лекарству с помощью механизма его удаления из раковых клеток. Поэтому важным и своевременным представляется поиск препаратов, против которых такой механизм не сработает. Решение этой практической задачи зависит от нашего понимания механизма апоптоза – биологической смерти клеток, запускаемой изменениями в мембранах митохондрий (рост проницаемости) и на поверхности цитоплазматической мембраны (появление сигнала «съешь меня» для макрофагов). Оба эти изменения вызваны свободными радикалами, которые образуются в пероксидазных реакциях, катализируемых комплексами цитохрома c с анионными липидами (Cyt-AL) в клеточной и митохондриальных мембранах. Фундаментальная научная задача проекта заключается в расшифровке механизма этих реакций. Решение этой фундаментальной задачи стало возможным благодаря использованию для изучения свободных радикалов нового метода кинетической хемилюминесценции в присутствии специфических активаторов, кумариновых производных С-525 и С-334, а также использованию, наряду с обширным арсеналом современных приборов и методов, высокочувствительного хемилюминометра, разработанного раннее исполнителями проекта. Полученные результаты внесут вклад в понимание механизма апоптоза и сделают возможным приступить к созданию лекарственного противоракового препарата, действие которого основано на апоптогенных и цитотоксических свойствах комплексов Cyt-AL

The solution of this practical task depends on our understanding of the mechanism of apoptosis - the biological death of cells triggered by changes in mitochondrial membranes (permeability transition) and on the surface of the cytoplasmic membrane (the appearance of the "eat me" signal for macrophages). Both these changes are caused by free radicals, which are formed in peroxidase reactions catalyzed by cytochrome c complexes with anionic lipids (Cyt-AL) in cellular and mitochondrial membranes. The fundamental science aspect of the project is to decipher the mechanism of these reactions. The solution of this fundamental problem is now possible because of development a novel technique of kinetic chemiluminescence in the presence of specific CL enhancer, coumarine derivatives of C-525 and C-334 for the study of free radicals, as well as the use, in addition to the extensive arsenal of modern instruments and methods, of a highly sensitive chemiluminometer developed by earlier projects' participants. The results of the present project will contribute to the understanding of the mechanism of apoptosis and make it possible to proceed with the development of a medicinal anti-cancer drug whose action is based on the apoptogenic and cytotoxic properties of Cyt-AL complexes.

1. Изучение растворимости комплекса цитохрома c с кардиолипином, фосфатидилсерином и фосфатидной кислотой позволит подобрать оптимальные концентрации для использования комплексов Cyt-AL в водорастворимой форме с известным содержанием цитохрома c и его комплексов. Отработка условий солюбилизации комплекса, который при высоких концентрациях в водных растворах выпадает в осадок, позволит использовать, в случае необходимости более высокие дозы препарата. 2. Изучение связывания комплексов Cyt-CL c целыми отмытыми эритроцитами и мембранами (отмытыми тенями) эритроцитов даст возможность подкрепить или опровергнуть центральную концепцию гипотезы о механизме проапоптогенного действия Cyt-CL: положение о том, что наносферы Cyt-CL встраиваются в липидный бислой мембран и там осуществляют процесс пероксидации липидов, который является механизмом апоптоза на его двух ключевых стадиях. 3. Будет изучено образования липидных радикалов в эритроцитах при добавлении цитохрома c (Fe2+ и Fe3+) к суспензии в аэробных условиях. Процесс пероксидации в мембранах протекает в гидрофобном окружении и включает в себя квази-липоксигеназную и липопероксидазную активность комплексов Cyt-AL. Ранее эти реакции были изучены в водном или гидрофобном растворителях, а теперь их существование будет показано в биологических мембранах. 4. Изучение связывания цитохрома c и его комплексов с анионными липидами (Cyt-AL) с целыми митохондриями и митохондриальными мембранами является распространением данных, полученных на клеточных мембранах (Пункт 2) на мембраны митохондрий. Если первый процесс приводит к заключительной стадии апоптоза – фагоцитозу клеток, то второй (в митохондриях) запускает сам апоптоз. 5. Отработка методов и предварительные опыты по изучению экстернализации фосфатидилсерина на поверхности клеток и активации каспаз в раковых клетках под действием комплексов Cyt-CL является необходимым этапом для последующих исследований по проекту, причем весьма трудоемким. 6. Результаты будут поданы в виде публикаций в журналы с высоким импакт-фактором. Выйти успеют лишь статьи, материал которых был получен заранее. Плана работ на 2019 год предполагает доработку в соответствии с результатами, полученными в 2018 году.

Были разработаны методы кинетической хемилюминесценции и аппаратура для исследования механизма свободно-радикальных реакций с участием комплекса цитохрома с с кардиолипином при поддержке Грантов РФФИ 96-04-49866- a, 98-04-49132-а, 03-04-49267-а, 06-04-08278-офи. 2. Эти методы были использованы при исследовании роли кардиолипина как триггера функции цитохрома с в митохондриях (Грант РФФИ 05-04-49765-а), механизма действия антиоксидантов в мембранных системах (Грант РФФИ 96-04-49866- a), образования свободных радикалов в клетках и митохондриях (Грант РФФИ 98-04-49132-а), изменения уровня свободных радикалов липидов в тканях животных при гипоксии и оксидативном стрессе (Грант РФФИ 03-04-49267-а), регуляции антиоксидантами и монооксидом азота образования радикалов на двух ключевых стадиях развития апоптоза (Грант РФФИ 08-04-01074-а), молекулярного механизма ранней стадии апоптоза - окислительных реакций, катализируемых комплексом цитохром с/кардиолипин (Грант РФФИ 11-04-01743-а). 3. В результате была детально изучена пероксидазная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином: расшифрован механизм катализируемых им реакций, определены константы скоростей частных реакций и показана возможность управления этими реакциями с помощью антиоксидантов, монооксида азота и лазерного облучения. 4. Методами центрифугирования нерастворимых в воде комплексов цитохрома c с кардиолипином, спектрофотометрии супернатанта и анализа структуры выпадающих из водного раствора микрокристаллов комплекса нами было показано, что в действительности комплекс Цит-КЛ представляет собой наносферу, в центре которой находится белок, а по периферии – монослой кардиолипина (Ю.А. Владимиров и сотр. Кристаллография, 2011. 56(4): стр. 712-7190), причем под действием кооперативных сил белок в глобуле сильно увеличивается в объеме, его конформация нарушается и он приобретает свойства пероксидазы (Ю.А. Владимиров и сотр. Биохимия 2013 78(10): 1391 – 1404).