В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Механизмы окислительного повреждения сетчатки глаза: редокс-регуляция с участием белков семейства нейрональных кальциевых сенсоровНИР

Mechanisms of oxidative damage to the retina: redox regulation involving neuronal calcium sensor proteins

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Механизмы окислительного повреждения сетчатки глаза: редокс-регуляция с участием белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров
Результаты этапа: Проект посвящен установлению взаимосвязей между окислением белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) и развитием светоиндуцированных дегенеративных процессов в сетчатке. На этапе 2018 года с использованием НКС трех подгрупп – фреквенинов (NCS1), рековеринов (рековерин) и GCAPs (GCAP1 и GCAP2) – проведен комплексный сравнительный анализ Са2+-зависимого окисления белков семейства in vitro в присутствии физиологических и патологических концентраций окислителя. Подтверждено, что преимущественным вариантом окислительной модификации всех указанных НКС кроме GCAP2 является их дисульфидная димеризация. При этом рековерин и NCS1 (содержат один цистеин) могут претерпевать также более глубокое необратимое окисление тиольной группы цистеина с образованием остатков сульфиновой/сульфоновой кислоты. Среди физиологически релевантных форм НКС к дисульфидной димеризации склонны Са2+-связанные конформеры GCAP1 (в наибольшей степени) и рековерина, в то время как в Mg2+-связанные НКС подобных форм не образуют. Для NCS1 впервые установлен механизм одновременной координации нескольких физиологических катионов, включая ионы цинка. Выявлено, что образование ковалентных димеров всех исследуемых НКС драматически ускоряется в присутствии Zn2+. Наиболее чувствительными к окислению являются Zn2+-NCS1 и Ca2+(Zn2+)-рековерин, в то время как в случае GCAP1 интенсивно окисляются обе аналогичные формы. Показано, что необходимым условием дисульфидной димеризации НКС является наличие третичной структуры у этих белков, а их чувствительность к окислению определяется поверхностной доступностью остатков цистеина. Продемонстрирована способность всех исследуемых НКС взаимодействовать (как in vivo, так и in vitro) с интегральным мембранным белком кавеолином-1, причем впервые показано, что это взаимодействие усиливается при их окислении. Методами молекулярного моделирования предсказана структура и определены энергетические параметры дисульфидных димеров НКС всех четырех подгрупп, включая подгруппу визининоподобных белков (нейрокальцин). Для GCAP1 и нейрокальцина (содержат больше одного цистеина) предсказаны окисляющиеся остатки цистеина (С18 и С38/185, соответственно), редокс-чувствительность которых будет проверяться с помощью сайт-направленного мутагенеза на следующем этапе проекта. По результатам всей совокупности экспериментов, проведенных in vitro и in silico, определено, что восприимчивость НКС к окислению с образованием дисульфидных димеров снижается в ряду Ca2+-GCAP1>апо-NCS1>Са2+-рековерин>>GCAP2. Разработана и охарактеризована модель фотоповреждения сетчатки крыс, с использованием которой продемонстрировано, что длительное облучение глаза видимым светом умеренной интенсивности (2500 лк, 14 ч), приводящее к развитию окислительного стресса и апоптоза нейронов сетчатки, сопровождается образованием дисульфидных димеров (но не окисленных мономеров) рековерина. При этом с использованием охарактеризованной ранее (за рамками проекта) модели фотоповреждения сетчатки кроликов показано, что помимо рековерина дисульфидной димеризации в условиях избыточной засветки подвержен только GCAP1, в то время как остальные НКС сетчатки соответствующих форм не образуют (GCAP2) или образуют в незначительных количествах (NCS1), что согласуется с результатами проведенных биохимических экспериментов и структурных расчетов. Высказано предположение, что, поскольку нейроны облученной сетчатки характеризуются ранним аберрантным повышением внутриклеточного кальция, образование ковалентных димеров GCAP1 и рековерина и усиление их взаимодействия с кавеолином-1 может быть одним из первых ответов этих клеток на окислительный стресс. При этом последующее повышение концентрации цинка (развитый процесс окислительного повреждения) будет приводить к окислению и, возможно, агрегации NCS1 и других белков семейства.
2 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Механизмы окислительного повреждения сетчатки глаза: редокс-регуляция с участием белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров
Результаты этапа: В 2019 году завершен очередной этап исследований, направленных на поиск взаимосвязей между окислением белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) и развитием светоиндуцированных повреждений нейронов сетчатки. Получены кДНК, произведено клонирование, экспрессия и выделение двух НКС сетчатки – VILIP1 и NCLD; получены антитела против этих белков. Разработана новая методика выделения рекомбинантных НКС, включающая разделение их миристоилированой и немиристоилированной форм. Показано, что VILIP1 окисляется независимо от присутствия Са2+ с образованием димерной и тримерной дисульфидных форм, в то время как NCLD образует преимущественно дисульфидные димеры даже в отсутствие сильных окислителей. Образование дисульфидных комплексов обоих НКС является структурно-детерминированным процессом, поскольку реакционная способность вовлеченных остатков цистеина зависит от наличия третичной структуры у этих белков. Восприимчивость VILIP1 и NCLD к окислению возрастает в присутствии Zn2+ (в особенности на фоне высокого Ca2+), что согласуется со способностью обоих белков (а также еще одного НКС, GCAP1) связывать этот катион, свободная концентрация которого в клетке повышается при окислительном стрессе. При этом координация цинка в VILIP1, NCLD и GCAP1 происходит по разным механизмам, однако всегда оказывает дестабилизирующий эффект на структуру этих белков и увеличивает их склонность к агрегации. Дисульфидная димеризация GCAP1 опосредуется только С18, в то время как в NCALD наиболее восприимчивым к окислению является С38, однако белок образует димеры всех трех типов – С38-С38, С185-С185 и С38-С185 – из которых первые два могут образовывать дисульфидные олигомеры. Все НКС сетчатки, включая VILIP1 и NCLD, способны к взаимодействию с кавеолином-1, которое ингибируется в присутствии Са2+, а также в результате фософорилирования Y14 кавеолина-1, характерного для окислительного стресса. NCS1 высокоаффинно связывает сигнальный фософлипид PI3P, причем связывание происходит с участком, расположенным вблизи С38 белка, и, как следствие, может быть чувствительным к его окислению. Все НКС сетчатки, включая VILIP1 и NCLD, проявляют редокс-чувствительность in vivo, причем их дисульфидная димеризация сопровождает развитие светоиндуцированного апоптоза фоторецепторов. Динамика накопления окисленных форм GCAP1 и NCLD в сетчатке различается, однако в обоих случаях окисление ассоциировано с индукцией двух путей апоптоза фоторецепторов (через активацию фактора AP-1 и UPR) и ингибируется в результате подавления как митохондриальной, так и цитоплазматической компоненты окислительного стресса. Полученные данные позволяет рассматривать GCAP1 и NCLD в качестве маркеров светоиндуцированного патологического процесса в сетчатке.
3 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Механизмы окислительного повреждения сетчатки глаза: редокс-регуляция с участием белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров
Результаты этапа: В проекте впервые установлена взаимосвязь между окислением белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС) и развитием светоиндуцированных дегенеративных процессов в сетчатке. На примере белков подгрупп фреквенинов (NCS1), рековеринов (рековерин), белков активаторов гуанилатциклаз (GCAP1 и GCAP2) и визининоподобных белков (VILIP1 и NCALD) показано, что НКС обладают чувствительностью к изменению редокс-потенциала среды и способны окисляться по остаткам цистеина с преимущественным образованием дисульфидных димеров. Восприимчивость конформеров НКС к окислению меняется в ряду Ca2+-GCAP1>апо-NCS1>Ca2+-NCALD>Са2+-рековерин>>GCAP2. Димеризация НКС является структурно-детерминированным процессом, обусловленным энергетической выгодностью образования их нековаленных комплексов, а также поверхностной доступностью и редокс-потенциалом вовлеченных цистеинов. Межмолекулярный интерфейс в димерах сформирован за счет гидрофобных контактов и может быть стабилизирован ионными и водородными связями. Образование нековалентных димеров НКС, скорее всего, предшествует окислению цистеинов и может снижать рКа их сульфгидрильных групп, тем самым способствуя формированию межмолекулярной дисульфидной связи. В случае рековерина и NCS1 эта связь формируется с участием их единственного, консервативного среди НКС остатка цистеина (С39 и С38, соответственно), в случае GCAP1 – его уникального N-концевого остатка С18 (одного из трех остатков этого типа в белке), в то время как NCALD образует все варианты димеров с участием обоих цистеинов белка (С38 и С185). Триггером дисульфидной димеризации НКС является повышение концентрации цинка, что согласуется с выявленной способностью всех исследуемых белков координировать этот катион. Хотя аффинность, стехиометрия и сайты связывания цинка в НКС различаются, общим феноменом является дестабилизация структуры и усиление агрегации этих белков в присутствии его повышенных концентраций, в особенности на фоне избытка кальция, т.е. в условиях, характерных для окислительного стресса клеток. Светоиндуцированный окислительный стресс и апоптоз нейронов сетчатки животных действительно сопровождается дисульфидной димеризацией НКС, причем окисление NCLD и GCAP1 является маркером начальной и развернутой стадий процесса. Инициация апоптоза происходит через активацию транскрипционного фактора АР-1 и реакции несвернутых белков (unfolded protein response, UPR), которая предотвращается в результате подавления как митохондриального, так и цитоплазматического компонентов окислительного стресса. Окисление НКС в условиях повышения редокс-потенциала среды отражается на функциональных свойствах этих белков. Так, функционирование NCS1 ассоциировано с узнаванием сигнальных фосфоинозитидов, которое может нарушиться в результате дисульфидной димеризации, поскольку сайт связывания этих компонентов мембраны расположен в непосредственной близости от С38 белка. Кроме того, большинство НКС взаимодействуют с интегральным мембранным белком кавеолином-1, и это взаимодействие ослабляется в результате фософорилирования последнего в клетках при окислительном стрессе, что может снизить сигнальную активность этих белков за счет нарушения их компартментализации с мембранными мишенями, сконцентрированными в рафт-структурах. Механизм регуляции редокс-статуса НКС в клетке включает их Zn2+-идуцированное окисление с образованием дисульфидных димеров, которые могут восстанавливаться с участием тиоредоксиновой системы, а в случае избытка формируют агрегаты, утилизируемые протеасомой. Перегрузка этой системы запускает апоптоз, по-видимому, через инициацию UPR. Выявленные НКС-опосредуемые процессы могут лежать в основе дегенерации нейронов сетчатки, поскольку нокдаун гена одного их таких белков (NCS1) замедляет развитие апоптоза, индуцируемого в условиях окислительного стресса.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".