ИСТИНА

Изоформа натриевого канала Nav1.5, называемая сердечной, в наибольшей степени отвечает за быстрый натриевый ток INa в кардиомиоцитах млекопитающих. Данный ток обеспечивает фазу деполяризации потенциала действия в рабочем миокарде предсердий и желудочков, а также в проводящей системе желудочков. От его величины зависит скорость проведения возбуждения в миокарде. Мутации в SCN5A, гене, кодирующем порообразующую альфа-субъединицу этого канала, приводят к развитию тяжелых, зачастую летальных аритмических заболеваний, таких как синдром Бругада и синдром удлиненного интервала QT третьего типа (LQT3). Увеличение неинактивируемой компоненты INa, так называемого задержанного натриевого тока INa,late признано одной из основных причин развития жизнеугрожающих желудочковых аритмий. Именно Nav1.5 является основной мишенью для антиаритмических препаратов класса I, что подчеркивает ключевое значение этого типа каналов для нормального функционирования сердца человека. В то же время физиологические механизмы регуляции быстрого натриевого тока в сердце исследованы пока недостаточно. Одними из регуляторов активности ионных каналов являются малые G-белки семейства Rho. Наиболее изученными белками Rho семейства являются RhoA, Rac1 и Cdc42. Rho, которые представляют собой ГТФазы, хорошо исследованы в сердечной сигнализации, в основном, в контексте формирования патологий, таких как гипертрофия миокарда, сердечная недостаточность, а также развития атриовентрикулярной блокады. Показана способность этих белков регулировать активность калиевых каналов Kv1.2, участвующих в реполяризации потенциалов действия в сердце крысы, калиевых каналов задержанного выпрямления Kv11.1 (HERG), обеспечивающих реполяризацию в сердце человека, кальциевых каналов L-типа Cav1.2, каналов аномального выпрямления Kir2.1, эпителиальных натриевых каналов ENaC и многих других. Часть этих эффектов реализуется малыми G-белками через регуляцию цитоскелета. G-белок RhoA может увеличивать плотность натриевого тока, переносимого Nav1.5, в клетках рака молочной железы, однако, участие G-белков семейства Rho в регуляции INa в кардиомиоцитах ранее не было исследовано. Проект предполагает комплексное изучение механизмов регуляции потенциалуправляемых натриевых каналов Nav1.5 малыми G-белками семейства Rho. На первом этапе будет проверена способность малых G-белков RhoA, Rac1 и Cdc42 вызывать изменения основных характеристик тока INa в клетках линии CHO, трансфицированных геном канала Nav1.5, а также выяснена возможная роль цитоскелета и основных сигнальных каскадов, запускаемых G-белками семейства Rho, в реализации этих изменений. Особое внимание будет уделено неинактивируемой компоненте натриевого тока – INa,late. Затем предполагается оценить вклад RhoA, Rac1 и Cdc42 в регуляцию INa в изолированных предсердных и желудочковых кардиомиоцитах крысы, а также на тканевом уровне – в многоклеточных препаратах предсердного и желудочкового миокарда крысы. Реализация проекта принципиально обновит фундаментальные представления о регуляции потенциалуправляемых натриевых каналов миокарда и позволит определить новые терапевтические мишени для антиаритмических препаратов.

Sodium channel isoform Nav1.5, also known as the cardiac isoform, is mostly responsible for fast sodium current INa in mammalian cardiomyocytes. This current forms depolarization phase of the action potentials in atrial and ventricular working myocardium, and also in ventricular conducting system. Its’ amplitude defines the velocity of excitation propagation through myocardium. Mutations in SCN5A gene, that codes the pore-forming α-subunit of this channel, lead to development of severe and often lethal arrhythmic diseases such as Brugada syndrome and long QT syndrome type 3 (LQT3). An increase in non-inactivating component of INa, so called delayed sodium current INa,late, is considered one of the main causes of life-threatening ventricular arrhythmias development. Nav1.5 is the main target for class I antiarrhythmic drugs. That emphasizes the role of this channel type for normal functioning of human heart. And at the same time the physiological mechanisms that regulate fast sodium current in myocardium still remain unclear. Rho-family small G-proteins are known as ion channels activity regulators. RhoA, Rac1 and Cdc42 are the most well-studied members of this family. Rho GTPases are well investigated in the scope of cardiac signaling, mainly in the context of myocardium hypertrophy, heart failure and development of atrioventricular blockade. It was also shown that these molecules are able to regulate the activity of potassium channels Kv1.2 that participate in repolarization of rat myocardium, delayed rectifier potassium channels Kv11.1 (HERG) that provide repolarization in human heart, calcium L-type channels Cav1.2, inward rectifier channels Kir2.1, epithelial sodium channels ENaC and others. These effects are partly mediated by small G-proteins via regulation of cytoskeleton. In breast cancer cells RhoA G-protein was shown to increase the density of sodium current mediated by Nav1.5 channels, but the role of Rho proteins in regulation of INa in myocardium have not been studied yet. The project suggests a complex investigation mechanisms of voltage-dependent sodium current Nav1.5 regulation by small Rho-family G-proteins. At the first stage it is planned to check the ability of small G-proteins RhoA, Rac1 and Cdc42 to cause changes in main INa current characteristics in CHO cells transfected with Nav1.5 gene, and also to study the possible role of cytoskeleton and main signaling cascades activated by Rho-family GTPases in mediation of these effects. Special attention will be paid to non-inactivating component of sodium current, INa,late. Then, it is suggested to evaluate RhoA, Rac1 and Cdc42 contribution to INa regulation in isolated ventricular and atrial rat cardiomyocytes, and also at tissue level, in atrial and ventricular preparations of rat myocardium. The realization of this project will update the fundamental conception of voltage-dependent sodium currents regulation in myocardium and will allow to spot new therapeutic targets for antiarrhythmic drugs.

Целью проекта является выяснение механизмов регуляции сердечной изоформы потенциалуправляемого натриевого канала Nav1.5 малыми G-белками семейства Rho. Для достижения этой цели будут решены следующие задачи: 1. Определить потенциальную способность малых G-белков RhoA, Rac1 и Cdc42 изменять характеристики натриевого тока (пиковой и задержанной компоненты), переносимого каналом Nav1.5, экспрессированным в гетерологической системе – клетках линии CHO. 2. Проверить возможность участия элементов цитоскелета, основной мишени регуляции G-белками семейства Rho, в реализации их действия на натриевый ток в клетках линии CHO. 3. Выяснить вклад основных сигнальных каскадов, запускаемых малыми G-белками семейства Rho, а именно каскада Rho-киназы и PI3-киназы, а также сигнальных каскадов протеинкиназы А и протеинкиназы С, регулирующих активность Nav1.5, в опосредовании эффектов Rho ГТФаз на натриевый ток в клетках линии CHO. 4. С помощью селективных ингибиторов малых G-белков RhoA, Rac1 и Cdc42 выяснить, участвуют ли они в регуляции натриевого тока (пиковой и задержанной компоненты) в изолированных желудочковых и предсердных кардиомиоцитах крысы. 5. В случае обнаружения эффектов ингибиторов RhoA, Rac1 и Cdc42 в кардиомиоцитах проверить эти результаты на тканевом уровне организации – в экспериментах на многоклеточных препаратах желудочкового и предсердного миокарда крысы. 6. Проверить, осуществляют ли малые G-белки семейства Rho непосредственное взаимодействие с ионным каналом Nav1.5