Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишахНИР

Сomparative analysis of plastome traits in Allioideae species adapted to contrasting habitats (deserts, highlands and lowlands)

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 5 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах
Результаты этапа: Было проведено сравнение полных последовательностей хлоропластных геномов видов рода Allium, отсеквенированных нами ранее: Allium paradoxum (M. Bieb.) G.Don, A. fistulosum L., A. cepa L., A. schoenoprasum L., A. platyspathum Schrenk, A. obliquum L., A. nutans L., A. sativum L., A. macleanii Baker, A. victorialis L., A. zebdanense Boiss. & Noë, A. pskemense B.Fedtsch. и A. ursinum L. Сравнительный анализ показал, что пластом A. paradoxum заметно отличается от пластомов других видов рода. Наиболее заметные отличия заключаются в наличии инверсии длиной 4825 б.п. (регион между генами ndhE и rpl32) в малом однокопийном повторе, а также в полной утрате или псевдогенизации всех NADH-генов. Было показано, что из-за большого количества небольших делеций пластом A. paradoxum является самым коротким из известных пластомов видов рода Allium, его длина составляет всего 145 819 п.н. Было установлено, что в пластоме A. paradoxum произошла дефункционализация всех генов NADH-дегидрогеназного комплекса (ndh гены), что, предположительно, связано с адаптацией данного вида растения к произрастанию в определенных экологических условиях (тенистые влажные леса). Также в хлоропластном геноме A. paradoxum, в отличие от остальных исследованных пластомов, делетирован ген rpl22. Пластом A. ursinum (вида, относящегося к той же (первой) эволюционной линии, что и A. paradoxum), напротив, был значительно больше похож на пластомы видов, относящихся ко второй и третьей эволюционным линиям. В нем не было найдено ни крупных перестроек, ни значительных расхождений в количестве генов. Пока что остается неясным, является ли пластом A. paradoxum исключением, или аналогичные эволюционные события обнаружатся также в пластомах его близких родственников из той же секции Briseis. По этой части результатов подготовлена статья (“Gene”, на рассмотрении рецензентов) У других видов рода Allium была обнаружена делеция еще ряда генов: ген infA отсутствует у A. victorialis и A. macleanii. Потеря этого гена из хлоропластного генома ранее была отмечена и других родов растений (Millen RS, Olmstead RG, Adams KL, et al., Many parallel losses of infA from chloroplast DNA during angiosperm evolution with multiple independent transfers to the nucleus. Plant Cell. 2001 Mar;13(3):645-58.) У этих же изученных нами видов луков (A. victorialis и A. macleanii), а также у A. macleanii, наоборот, присутствует ген psaC, которого не было отмечено в пластомах других изученных видов рода Allium. У видов A. platyspathum, A. obliquum, A. schoenoprasum была обнаружена делеция гена rps16. Дефункциализация гена rps16, вплоть до полной его потери из хлоропластного генома, была показана и для других групп высших растений (например, 10.1093/dnares/dsx006). На основании анализа полученных расчетных данных были установлены участки пластомов видов рода Allium, которые отличаются скоростью накопления мутаций (см. таблицу в приложении 1). К ним относятся практически все гены и межгенные спейсеры малого однокопийного участка пластома (SSC), причем стоит отдельно отметить высокую скорость эволюции генов и межгенных спейсеров рядом с границами с инвертированными повторами: гены rps15 и ycf1_2 на стыке SSC и IRa (rate=2,44 и 3, соответственно) и ycf1 и rpl32 на границе SSC и IRb (rate=3,05 и 5,5, соответственно). В самих инвертированных повторах повышенная скорость эволюции (rate=1-1.2) была отмечена для единичных открытых рамок считывания (orf42 в обоих повторах, orf56 в IRa), а также для гена ycf15, расположенного в IRb. Невысокая скорость эволюции (1.53) была отмечена только в одном межгенном спейсере: rpl2_4-trnH2. В большом однокопийном регионе пластома (LSC) максимальная скорость эволюции была показана для генов trnS, rps32, psaI и infA (rate=2.7-4.9). Последние два (psaI и infA) участвуют в адаптации растений к стрессовым условиям. Достаточно высокая (rate=2.03-2.4) скорость эволюции оказалась у генов matK, rps16, psbI и petG, Повышенная скорость эволюции последовательности гена matK отмечалась в работах многих авторов (например, Khidir W. Hilu and Michelle M. Barthet (2008) Mode and Tempo of matK: Gene Evolution and Phylogenetic Implications Evolutionary Biology from Concept to Application, Chapter 10). Продукт гена psbI участвует в стабилизации антенны фотосистемы II и участвует в адаптации организма к стрессовым факторам, в том числе и с повышенным уровнем освещенности (10.1104/pp.107.107805, doi: 10.1074/jbc.M604888200). Поэтому его высокая скорость эволюции также может быть связана с адаптацией растений к стрессовым факторам. Продукт гена petG участвует в сборке комплекса цитохромов (Berthold DA, Schmidt CL, Malkin R. The deletion of petG in Chlamydomonas reinhardtii disrupts the cytochrome bf complex. J Biol Chem. 1995 Dec 8;270(49):29293-8.), причем его отсутствие (вместе продуктами генов PetL и PetN) приводит к увеличению чувствительности растений к свету (doi: 10.1104/pp.107.100131) Повышенная скорость эволюции в области LSC (rate=1.02-1.86) также была отмечена для межгенных спейсеров: psbA-trnH, rps16-trnK2, trnQ-rps16, psbi-psbK, atpA-trnR, rpoC2-rps2, trnT-trnL1, trnL2-trnF, ycf4-cemA, petA-psbJ, petD-rpoA. Большая часть из них используется для установления филогенетического родства между разными видами растений. С похожей скоростью эволюционируют гены, кодирующие ATP synthase (atpE, atpA, atpF, atpI), белки, участвующие в сборке фотосистемы II (psbB, psbF, psbI, psbH, psbJ, psbM), гены, кодирующие большие (rpl14, rpl 20, rpl 22, rpl 33, rpl 36) и малые (rps 3, rps 8, rps 12-exon2) субъединицы рибосом, РНК полимеразы (rpoA, rpoC2, rpoC1 exon1), цитохром (petL). Часть 2 Основной целью проекта является поиск генов, а также некодирующих участков генома, которые находятся под воздействием отбора у видов Allium, адаптировавшихся к жизни в экстремальных условиях. Для решения конкретной задачи, связанной с эволюцией пластомов растений, относящихся к роду Allium, необходимо понимать основные пути эволюции пластома растений, входящих в подсем. Allioideae относительно эволюции пластома семейства Amaryllidaceae в целом. Это позволит отличить нейтральные события эволюции пластома у рода Allium (например, делеции генов или некодирующих участков), от особенностей, возникших в результате давления отбора. Таким образом, для решения указанной конкретной подзадачи вполне допустимо использовать растения, которые интересны с точки зрения анализа эволюции последовательностей пластомов семейства. Поэтому было запланировано провести секвенирование пластомов видов растений, относящихся к родам Tulbaghia, Amaryllis, Nothoscordum, Tristagma и Gilliesia. За отчетный период было проведено секвенирование хлоропластных геномов Tulbaghia ludwigiana Harv., Amaryllis belladonna L. и Nothoscordum bivalve (L.) Britton. Пластомы видов растений, относящихся к родам Tristagma и Gilliesia, секвенировать не удалось, поскольку растительный материал планировалось получить при культивировании растений из семян, полученных из зарубежных коллекций, однако присланный семенной материал оказался нежизнеспособным. Поэтому в качестве альтернативы были секвенированы виды растений, относящихся к родам Ixiolirion, Gethyllis, Ipheion и Caliphruria (а именно: Ixiolirion tataricum (Pall.) Schult.&SCHULT.F., Gethyllis namaquensis (Schönland) Oberm., Ipheion uniflorum (Raf.) Traub., Caliphruria subedentata Baker.). Род Ixiolirion, по мнению одних авторов - монотипный, других - олиготипный, представляет собой крайне изолированную систематически группу однодольных, точное положение которой внутри порядка Asparagales до сих пор не вполне ясно. Исторически по ряду морфологических признаков этот род сближали с амариллисовыми и даже включали в это семейство, однако полное отсутствие алкалоидов, столь характерных для амариллисовых в узком смысле, вызывало сомнения в родстве этих групп ещё до распространения молекулярной филогении (Takhtajan, 1997). Традиционно было также выделение рода в отдельное семейство с неясным родством внутри однодольных. С момента возникновения системы APG обнаружилось, что по некоторым молекулярным маркерам иксиолирионы близки представителям сем. Tecophileaceae, ещё одной изолированной группе однодольных с не вполне ясным систематическим положением и с крайне дизруптивным ареалом (Чили и Южная Африка), географически очень далеким от области распространения Ixiolirion (пустыни и степи Передней, Средней и Центральной Азии). Таким образом, мы выбрали род Ixiolirion в качестве представителя аутгруппы. Дополнительными аргументами послужили предположения о том, что сиквенс полного пластома этого рода позволит уточнить положение этой сложной группы в порядке Asparagales и сравнить его с последовательностями пластомов симпатрических этой группе амариллисовых, обладающих схожими адаптациями к аридности. Давно отмечаемое морфологическое сходство Ixiolirion с амариллисовыми может оказаться внешним проявлением параллелизма в приспособлениях к условиям пустынь; возможное выявление параллелизмов между этими группами в строении пластома позволит приблизиться к пониманию того, как эти адаптации работают на генном уровне. Другие растения со «скамейки запасных» (Gethyllis, Caliphruria, Ipheion) относятся к семейству Amaryllidaceae. Род Gethyllis, распространённый преимущественно в засушливых биотопах Южной Африки - один из представителей так называемого "ядра" (core) семейства, относительно близок типовому роду Амариллис. Южную Африку нередко считают центром, откуда начались дивергенция и расселение семейства амариллисовых, поскольку именно здесь, на относительно небольшой территории, наблюдается наибольшее разнообразие семейства на уровне крупных таксонов. Виды рода Gethyllis, приспособившиеся к экстремально жестким условиям произрастания в пустынях, выработали значительное количество разнообразных морфологических адаптаций для минимизации испарения и улавливания атмосферной влаги, многие из которых независимо развились у иных групп амариллисовых в пустынях других континентов, в частности, у пустынных представителей рода Allium. Caliphruria - представитель так называемой андской клады амариллисовых, объединенной географией и общим происхождением [Meerow et al., 2000 «Phylogeny of the Amaryllidaceae: molecules and morphology»]. Мы планировали изучить пластомы представителей основных больших ветвей амариллисовых, поэтому анализ представителя этого рода подходит для решения задачи. Кроме того, это обитатель самого нижнего яруса дождевых тропических лесов, приспособленный к условиям низкого освещения, но не испытывающий недостатка во влаге, как и медвежий лук, Allium ursinum, и лук парадоксальный, Allium paradoxum, которые были нами исследованы (см. первую часть отчета). Поскольку у парадоксального и медвежьего луков были обнаружены значимые различия в количестве и последовательностях генов пластомов, часть из которых очевидно связана с адаптацией к среде обитания, а Caliphruria демонстрирует схожий с этими видами набор морфологических адаптаций, то в итоге этот род был включен нами в список исследуемых растений. Нам представилось интересным сравнить последовательность пластома растений этого рода с ближайшими американскими амариллисовыми, адаптировавшимися к жизни в сухих солнечных биотопах. Наконец, Ipheion (Ифейон) – относится к подсемейства Луковые, но не к роду Allium [Meerow et al., 2000 «Phylogeny of the Amaryllidaceae: molecules and morphology»]. Образцы растений Ipheion uniflorum (ваучер № 01-17-0119-20), Tulbaghia ludwigiana (ваучер № 10-17-0026-10), Nothoscordum bivalve (ваучер № 01-17-0026-10) были получены из коллекции ботанического сада Оснабрюкского университета Германии, Gethyllis namaquensis, Amaryllis belladonna и Caliphruria subedentata из Ботанического сада МГУ им. М.В. Ломоносова (филиал “Аптекарский огород”) в г. Москва, образцы Ixiolirion tataricum собраны в ходе поездки в Киргизию в 2018 году. Из вышеуказанных образцов было проведено выделение хлоропластной ДНК, которую использовали для дальнейшей работы. Высокопроизводительное секвенирование проводили на платформе Illumina MiSeq и платформе полупроводникового секвенирования IonTorrent S5. Для Illumina парноконцевые библиотеки (2х250 п.о.) были подготовлены с помощью набора NEBNext® DNA Library Prep Master Mix Set for Illumina (E6040, NEB, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для IonTorrent S5 были приготовлены библиотеки с помощью набора Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit (4471269, Thermo Fisher, США) на чипах для секвенирования Ion 540 (A27766, Thermo Fisher, США). Собрку генома осуществляли по следующему биоинформатическому протоколу: 1) удаление адаптерных последовательностей, фильтрация и удаление коротких ридов (меньше 10 п.о.) c помощью программного обеспечения bbduk в составе пакета BBTools (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/); 2) Объединение парных ридов с помощью программного обеспечения bbmerge в составе пакета BBTools; 3) Сборка обработанных данных секвенирования de novo с помощью ассемблера Spades 3.12.0 (http://cab.spbu.ru/software/spades/) c установленными параметрами на аккуратную сборку с коррекцией ошибок ридов (алгоритм BayesHammer) и мисматчей при сборке (алгоритм BWA); 4) картирование полученных контигов на референсные последовательности хпДНК из базы данных GenBank и оценка качества сборки программой QUAST 5.0 (http://cab.spbu.ru/software/quast/). В результате проведённых работ были секвенированы 9 хлоропластных ДНК и собраны de novo драфты 4 хлоропластных геномов. Сборка Ipheion uniflorum состоит из 3671 контигов, из которых 11 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 29524 п.о., N50=1215, L50=977. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 52,3%. Сборка Tulbaghia ludwigiana состоит из 5330 контигов, из которых 9 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 44309 п.о., N50=1149, L50=1564. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 55,5%. Сборка Ixiolirion tataricum состоит из 101497 контигов, из которых 4 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 18898 п.о., N50=928, L50=39691. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 17,8%. Сборка Nothoscordum bivalve состоит из 14137 контигов, из которых 47 длиной более 10000 п.о. Самый длинный контиг равен 50989 п.о., N50=1468, L50=3604. Общий процент покрытия контигов на референсные хлоропластные геномы 58,6%. С учётом того, что хпДНК содержит длинные инвертированные повторы, которые программы по сборке геномов не способны корректно учитывать, величина покрытия драфтов будет соответствовать ~80-90% у всех, кроме Ixiolirion tataricum - ~50%. Сборку Ixiolirion tataricum необходимо доработать. Резкое отличие от других собранных драфтов по покрытию может свидетельствовать о наличии бактериального загрязнения, нарушающего правильную сборку, что требует дополнительной фильтрации данных секвенирования. Для видов Amaryllis belladonnа, Nothoscordum bivalve, Gethyllis namaquensis, Caliphruria subedentata были получены данные секвенирования в количестве, которое достаточно для сборки пластомов. В настоящее время проводятся работы по сборке пластомов. Собранные draft-последовательности пластомов представлены на интернет ресурсе нашей научной группы www.chloroplast.ru. Часть 3 В ходе полевого исследования в Киргизии на северных склонах Киргизского хребта в районе ущелья Кегеты у высокогорного озера Кёль-Тор (2725 метров над уровнем моря) и его окрестностях (Ыссык-Атинский район) был проведен сбор образцов видов A. semenovii и A. platyspathum из различных популяций. Эти образцы планируется в дальнейшем использовать для проведения популяционных генетических исследований. Также были собраны другие представители средне- и высокогорной флоры, в том числе и Ixiolirion tataricum, часть из которых в живом виде поступила в коллекцию ботанического сада, тогда как гербарные образцы переданы в гербарий МГУ им. М.В. Ломоносова.
2 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах
Результаты этапа:
3 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. Эволюция пластомов у растений подсем. Allioideae, адаптировавшихся к обитанию в различных экологических нишах
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".