ИСТИНА

Ионные каналы представляют большой интерес для современной биофизики. Они участвуют во многих физиологических процессах у живых организмов, начиная от формирования потенциала действия и заканчивая поддержанием объема клетки. Нарушение их работы приводит к ряду серьезных наследственных заболеваний. Изучение свойств и функционирования ионных каналов невозможно без определения их структурных особенностей. Зная пространственную структуру, можно детально изучать конформационные перестройки при активации/инактивации канала, используя различные методы структурной биологии, а также компьютерное моделирование. Установление механизма функционирования потенциал-зависимых каналов семейства EAG (Kv10) осложнено недостатком сведений об их пространственной организации. Целью данной работы является получение молекулярной структуры закрытого ионного канала Kv10.2 в детергенте или в липидном окружении и его изолированного С-концевого домена для создания в дальнейшем новых лекарственных средств, нацеленных на диагностику и лечение онкологических заболеваний.

Ionic channels are of great interest to modern biophysics. They participate in many physiological processes in living organisms from the formation of action potential to the maintenance of cell volume. Disturbance to their work leads to a number of serious hereditary diseases. The research on the properties and functioning of ion channels is impossible without determining their structural features. Advances in our understanding of the spatial structure make it possible to perform a detailed study of conformational rearrangements upon the activation / inactivation of the channel with the help of various methods of structural biology, as well as computer modeling. The establishment of a mechanism for the functioning of potential-dependent channels of the EAG family (Kv10) is complicated, due to the lack of information on their spatial organization. The ultimate aims of this work are to obtain the molecular structure of the closed ion channel Kv10.2 in a detergent or lipid environment and its isolated C-terminal domain for the future development of new drugs for cancer treatment and diagnosis.

В результате выполнения проекта будет впервые экспрессирован и очищен изолированный С-концевой CAD-домен ионного канала Kv10.2. Будет изучена его способность к олигомеризации, а также возможное влияние мутаций на нарушение этого процесса. В рамках работы ожидается получение впервые трехмерной структура полноразмерного канала Kv10.2 в закрытой конформации в детергенте или в липидном окружении. На сегодняшний день не существует аналогичных моделей потенциал зависимых калиевых каналов, все модели получены или в открытом или в псевдо-закрытом состоянии. Получение модели закрытого калиевого канала и позволит уточнить механизм активации потенциал зависимых каналов, что в свою очередь даст возможность предсказывать влияние низкомолекулярных соединений, в том числе лекарственных средств, на функционирование каналов семейства Kv10 методами молекулярного моделирования.

У руководителя проекта имеется значительный научный задел по проекту. Все предлагаемые методы и подходы уже использовались заявителем в предыдущих исследованиях. - Разработан протокол экспрессии полноразмерных и транкированных каналов Kv10.2 в клетках COS-1 и очистки с использованием аффинного тага. Разработан протокол получения делеционных по N-концу мутантов канала Kv10.2 (Глухов, 2017, диссертация на соискание степени к.б.н. по специальности “Биофизика”). - Методом электронной просвечивающей микроскопии с анализом изображений получена трехмерная структура канала Kv10.2 с удаленным доменом PAS (Глухов с соавт., 2016). - С помощью электрофизиологических методов (whole-cell patch-clamp) продемонстрировано закрытие канала Kv10.2 при ко-экспрессии канала с пептидом, имитирующим линкер S4-S5 и при окислении цистеинов, введенных в позиции 339 в S4-S5 линкере и 474 в S6 спирали (Malak, Gluhov et al, статья находится на рассмотрении в JBC). - Изучено строение липодисков на основе амфифильных сополимеров со встроенными ионными каналами методом электронной просвечивающей микроскопии (Багров, … Глухов, с соавт., 2016). - Метод крио-электронной микроскопии успешно применялся заявителями для изучения строения белковых кластеров мутантного грамицидина в липосомах (Antonenko, Gluhov et al, 2015).

В результате выполнения проекта в конце первого года будут получены очищенные образцы белка CAD-домена канала Kv10.2. - Изучена способность данного домена к олигомеризации и влияние мутаций, нарушающих данное взаимодействие. - Белок канала Kv10.2 будет экспрессирован в эукариотических клетках и будут подобраны условия для встраивания его в нано- или липодиски. - Полученные данные будут опубликованы в виде статьи в международном рецензируемом журнале (предположительно, BBRC, IF 2.5, Q1) и доложены на международной конференции FEBS.