ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
С каждым годом растет число устойчивых к известным антибиотикам бактериальных штаммов, поэтому совершенно необходимо вести поиск новых антибактериальных препаратов. В ходе выполнения проекта, при помощи разработанной ранее системы определения механизма действия антибиотика на стадии первичного скрининга, планируется проанализировать несколько тысяч синтетических молекул и несколько сотен природных образцов на присутствие веществ, подавляющих рост бактериальной клетки за счет нарушений в системе биосинтеза ДНК. Для обнаруженных активных молекул будет проведено детальное изучение механизма действия при помощи in vivo и in vitro методов – определение минимальной ингибирующей концентрации, поиск мутаций устойчивости, анализ ингибирования активности различных ферментов, связанных с репликацией ДНК (полимеразы, гиразы, топоизомеразы и т.д.). При подготовке к проекту нами уже найден крайне интересный антибиотик – нибомиоцин, вызывающий SOS-ответ за счет нарушения работы гиразы, этот антибиотик нарушает рост как клеток дикого типа, так и с мутацией, дающей устойчивость к фторхинолонам. В ходе проекта будет завершено детальное изучение механизма этого антибиотика, а также сформулированы предложения по его рациональному улучшению.
Every year the number of bacterial strains resistant to known antibiotics grows, so it is absolutely necessary to search for new antibacterial drugs. Using previously developed system for determination of the mechanism of action of the antibiotic at the stage of primary screening, it is planned through the project to analyze several thousand synthetic molecules and several hundred natural samples for the presence of substances that suppress the growth of the bacterial cell due to disturbances in the DNA biosynthesis system. For the active molecules, a detailed study of the mode of action using in vivo and in vitro methods will be performed to determine minimum inhibitory concentrations, to search for resistance mutations, to analyze the inhibition of the activity of enzymes associated with DNA replication (polymerase, gyrase, topoisomerase, etc.). ). We've already found a very interesting antibiotic, nybomycin, which causes an SOS response due to disruption of the gyrase. The antibiotic disrupts the growth of both wild-type cells and with a mutation that gives resistance to fluoroquinolones. During the project, a detailed study of the mechanism of action of the nybomycin will be completed, and proposals for its rational improvement will be made.
Цель: Обнаружить новые антибиотики, определить молекулярный механизм действия, оценить терапевтический потенциал, предложить варианты по рациональному улучшению. Задачи: 1) Провести анализ большого числа природных (несколько сотен) и синтетических (несколько тысяч) образцов при помощи репортерной конструкции, позволяющей одновременно определять эффективность действия и механизм действия. 2) В случае обнаружения активности в природном образце (культуральной жидкости) провести очистку и идентификацию. 3) Изучить механизм действия in vivo: A. Оценить эффективность действия на наборе бактериальных штаммов. Б. Оценить токсичность на нескольких клеточных линиях человека. В. Определить мутации обеспечивающие устойчивость и оценить частому их возникновения. 4) Изучить механизм действия in vitro при помощи ингибирования активности мишени антибиотика в бесклеточной системе. 5) Получить структурные данные о взаимодействии антибиотика и мишени.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 октября 2018 г.-1 октября 2019 г. | Направленный поиск и изучение новых антибиотиков, вызывающих SOS-ответ в бактериальной клетке |
Результаты этапа: В ходе анализ синтетических и природных образцов на наличие соединений, вызывающих в бактериальной клетке SOS-ответ, были обнаружены новые молекулы с антибактериальной активность, а также найдены новые продуценты антибиотиков, индуцирующих SOS-ответ. Впервые показана антибактериальная активность и активация SOS-ответа 3,5-дибензоил-спиропиперидиновыми солями, а также была обнаружена антибактериальная активность производных а-азепанобетулиновой кислоты. Выявлены новые продуценты антибиотиков, индуцирующих SOS-ответ в бактериальной клетке, претомомицина и нафтиридиномицина, новые продуценты могут быть использованы для наработки вышеописанных антибиотиков. Подобраны оптимальные условия продуцирования редкого антибиотика нибомицина, продуцируемого бактериями симбионтами муравьев. На молекулярном изучен механизм действия этого антибиотика, природного ингибитора бактериальных топоизомер второго типа, в том числе мутантных форм, неподверженных действия фторхинолонов. Нибомицин ингибирует работу как ДНК-гиразу E.coli дикого типа, так и устойчивую к действию фторхинолонов форму, при этом происходит накопление никированной и линейной формы ДНК, в отличие фторхинолонов, в присутствии которых накапливается только линейная форма. | ||
2 | 1 октября 2019 г.-1 октября 2020 г. | Направленный поиск и изучение новых антибиотиков, вызывающих SOS-ответ в бактериальной клетке |
Результаты этапа: Важнейшие результаты, полученные в ходе реализации проекта ★ Проанализирован большой набор природных и синтетических молекул, обнаружены новые молекулы с антибактериальной активностью, для некоторых из них показано, что их действие вызывает SOS-ответ. Анализ проводили про помощи репортерной системы pDualrep2, позволяющей определять механизм действия антибиотика, был проанализирован большой набор синтетических и природных образцов. Конструкция pDualrep2 содержит два флуоресцентных белка - turboRFP (красный флуоресцентный белок) и - Katushka2S (дальний красный флуоресцентный белок). Экспрессия белка Katushka2S увеличивается в присутствии антибиотиков, подавляющих трансляцию. Экспрессия второго репортерного гена, turboRFP, увеличивается в присутствии антибиотиков, вызывающих повреждение ДНК. Среди протестированных синтетических молекул, обнаружено, что 5-дибензоил-спиропиперидиновые соли подавляют рост бактериальной клетки и вызывают SOS-ответ. Наиболее активными оказались производные, содержащие пирролидиновый заместитель. Результаты опубликован в статье “Строение и антибактериальная активность (опосредованная SOS-ответом) спиропиперидиниевых солей, полученных циклизацией оснований Манниха арилалифатических 1,5-дикетонов”. В дальнейшем планируется определить молекулярные основы индуцирования SOS-ответа данными соединениями. В ходе выполнения проекта при помощи вышеописанной репортерной системы было показано, что производное а-азепанобетулиновой кислоты, подавляет рост бактериальных клеток не индуцируя SOS-ответ. Полученные результаты были опубликованы в журнале: Natural Product Communications При исследовании культуральных жидкостей почвенных бактерий, предоставленных институтом по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе, были обнаружены продуценты антибиотиков, вызывающих SOS-ответ. После очистки и определения структуры оказалось, что один из штаммов продуцирует претомомицин (Pretomaymycin), а другой нафтиридиномицин ( Naphthyridinomycin). Оба антибиотика известны, механизм их действия, ассоциированный с нарушениями в синтезе ДНК, изучен, в тоже время сами штаммы представляют собой интерес, так как могут быть использованы для наработки вышеописанных антибиотиков. В ходе исследования нескольких сотен природных образцов, предоставленных коллабораторами из Китая (лаборатория профессора Суна) были также обнаружены ингибиторы, вызывающие SOS-ответ. В этом исследовании 261 актинобактериальный штамм были выделены из 8 образцов почвы мангровых лесов. 83 штамма было выбрано для оценки антибактериальной активности и механизма действия с помощью двойной флуоресцентной репортерной система (pDualrep2), разработанной коллективом. Тридцать два штамма проявляли антагонистическую активность по крайней мере против одного из патогенов ESKAPE класса. Четыре штамма (B475, B486, B353 и B98) показали сильную ингибирующую активность против грамположительных бактерий и индуцированние SOS-ответ и повреждение ДНК. Один штамм Micromonospora (B704) проявлял ингибирующие активность против нескольких патогенов и индуцировал репортер на ингибиторы трансляции. Поиск по базе данных Chemspider и анализ данных масспектрометрии выявил семь антибиотиков хиноксалинового ряда, включая хиномицин А, эхиномицин и другие пять предположительно новых аналогов были обнаружены в культуральном бульоне штамма B475. Результаты данного исследования были опубликованы в журнале Journal of Antibiotics –«Exploitation of Potentially New Antibiotics from Mangrove Actinobacteria in Maoweihai by Combination of Multiple Discovery Strategies». Кроме того было продолжено изучение антибиотика нибомицина. Бактериальные топоизомеразы II типа, ДНК-гираза и топоизомераза IV являются мишенями для многих антибиотиков, включая фторхинолоны. К сожалению, многие бактерии легко приобретают устойчивость к фторхинолонам в результате мутаций в генах ДНК-гиразы или топоизомеразы IV. Возникновение резистентных патогенных штаммов - глобальная проблема здравоохранения, и существует несколько решений. Одним из них является использование нибомицинов, необычного класса соединений, «обратных антибиотиков», которые избирательно подавляют рост устойчивых к фторхинолонам бактерий и нацелены на мутантную форму ДНК-гиразы, будучи неактивными в отношении штаммов дикого типа. Однако сильный «обратный» эффект был продемонстрирован только для некоторых организмов, устойчивых к фторхинолонам из-за мутации S83L / I в субъединице GyrA ДНК-гиразы. В этом исследовании мы наблюдали, что гираза дикого типа E. coli и мутант GyrA S83L, устойчивые к фторхинолонам, оба почти одинаково чувствительны к нибомицину. Более того, мы продемонстрировали, что топоизомераза IV E. coli и топоизомераза IIα человека ингибируются нибомицином; последнее также объясняет цитотоксичность соединения. Статья была направлена в журнал Antimicrobial agents and chemotherapy, получен отзыв, допускающий публикацию после дополнительных экспериментов, которые из-за карантина были закончены только ко времени подачи отчета. Обновленный вариант публикации в ближайшее время будет направлена в редакция, так как после восстановления доступа в лаборатории (осень 2020) на вопросы рецензентов удалось получить ответы. Изучение взаимодействия нибомицина и бактериальных топоизомераз будет продолжено, в том числе и на структурном уровне – запланировано изучение комплекса гиразы E.coli и нибомицина при помощи криоЭМ. Сопоставление результатов, полученных в ходе реализации проекта с мировым уровнем ★ В связи с распространением устойчивости к классическим антибиотикам поиском новых молекул с антибактериальной активностью занимаются многие лаборатории и фармакологические компании. В случае анализа природных образцов переоткрытие известных антибиотиков продуцирцемых актинобактериями, особенно стрептомицетами, является серьезной проблемой, поэтому быстрая идентификация известного антибиотика является крайне актуальной. Сочетании биосенсора, определяющего механизм действия, и современных масс-спектрометрических подходов позволило идентифицировать антибиотики, вызывающие SOS-ответ. В случае синтетических молекул преимущество данного проекта заключается в непосредственном контакте с группами, синтезирующими новые молекулы, обнаружение соединений с антибактериальной активностью среди таких молекул становится отправной точкой для их дальнейшей модификации. В данной работе найдены два новых структурных мотива обладающих антибактериальной активностью, для одного из них показано, что активность связана с индукцией SOS-ответа. Антибиотик нибомицин в последние годы привлек внимание ученых, так как данный антибиотик подавляет работу только фторхинолонустойчивых штаммов золотистого стафилококка. Было выдвинуто предположение, что нибомицин – это «обратный антибиотик», который действуют также как и фторхинолоны, но нарушают работу гиразы с мутациями, обеспечивающими устойчивость к фторхинолонам. Однако, наши данные опровергают это предположение по крайней мере в отношении E.coli, так как нибомицин подавлял рост клеток без мутаций в гиразе и с мутациями устойчивости к фторхинолонам . В ходе дальнейшего исследования было изучено влияние нибомицина на работу большого ряда топоизомераз при помощи постановки реакции в бесклеточной системе и были сделаны следующие выводы: 1. Нибомицин ингибирует релаксирующую и суперскручивающую активность ДНК-гиразы E.coli. При этом происходит накопление никированной и линейной формы ДНК, в отличие фторхинолонов, в присутствии которых накапливается только линейная форма. 2. ДНК-гираза не является единственной мишенью нибомицина. Было показано, что он действует на про- и эукариотические топоизомеразы обоих классов. 3. Согласно результатам молекулярного докинга нибомицин связывается в гидрофобном кармане на границе двух субъединиц А, частично интеркалируя в ДНК на стадии одноцепочечного разрыва в каталитическом цикле ДНК-гиразы E.coli. Мутации Asp87Tyr, Asp82Gly и Asp82Glu по разному влияют на чувствительность ДНК-гиразы к нибомицину. Таким образом были получены новые данные, описывающие фундаментальные основы действия нибомицина – в настоящий момент публикация готовится к повторном отправке после ответа на замечания рецензентов. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".