Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человекаНИР

Molecular-genetic mechanisms of genome instability and mutagenesis in animals and humans

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В 2016 году исследования велись в двух направлениях: 1) исследование роли генов Grp и Iris, доместицированных от ретровирусов, в иммунном ответе дрозофилы; 2) изучению генов, определяющих правильное развитие и функционирование гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы у человека. Исследована экспрессия генов Grp и Iris на уровне транскрипции и трансляции, проведен функциональный анализ этих генов. Выявлена их возрастоспецифичная экспрессия: базальный уровень экспрессии на стадии эмбрионов и личинок и высокий уровень – на стадии имаго. Показано, что оба гена транскрибируются в соматических тканях. Относительно высокая экспрессия гена Grp выявлена в тканях кишечника, а высокая экспрессия гена Iris – в тканях корпуса. Для поиска белковых продуктов генов Grp и Iris, гомологов генов gag и env ретровирусов дрозофилы, поставлена вестерн-гибридизация тотального экстракта белков, выделенных из взрослых особей D. melanogaster с сыворотками первичных антител к белкам Grp и Iris. Показано, что белки Grp и Iris обнаруживаются в мембранной фракции. Выявлено, что присутствие функционального ретровируса gypsy вызывает повышение уровня экспрессии гена Grp в соматических тканях каркаса самок и не оказывает влияния на уровень экспрессии гена Iris. Исследован уроевнь экспрессии генов Iris и Grp у самок линии дикого типа (D-32) в ответ на введение в организм грамположительных и грамотрицательных бактерий.Показано, что ген Grp индуцируется введением в организм B.cereus, а ген Iris не индуцируется бактериальной инфекцией. Исследовано воздействие на экспрессию генов Iris и Grp стрессовых факторов: окислительного стресса, голодания, холодового и теплового шока. Обнаружено повышение уровня экспрессии гена Grp в ответ на голодание у самок D.melanogaster и подавление экспрессии гена Iris в ответ на тепловой шок, окислительный стресс и септическую травму. Получены данные о понижении экспрессии гена Grp в результате инъекции M. luteus. В экспериментах по активации путей иммунного ответа Imd, Toll и Jak-STAT у особей дикого типа были получены данные, указывающие на возможное участие пути Jak-STAT в контроле экспрессии гена Grp. Для выяснения роли сигнального пути Jak- STAT в ответе на ретровирусную инфекцию проведен сравнительный анализ экспрессии генов Grp и vir-1, эффектора пути Jak- STAT. Обнаружен повышенный уровень экспрессии STAT-индуцируемых изоформ vir-1 в линии MS, что, вероятно, связано с вирусной активацией Jak-STAT-сигнального пути. Показано, что ретровирус gypsy активирует гены Grp и vir-1 у самок в каркасе брюшка, каркасе головы и задней кишке. Проведен сравнительный анализ экспрессии генов Grp и vir-1 у гибридов D.melanogaster, полученных от реципрокных скрещиваний линий SS и MS, а также скрещиваний этих линий с линией дикого типа. Выявлено влияние нарушения контроля экспрессии мобильных элементов со стороны локуса flamenco, и влияние присутствия активной копии gypsy на экспрессию генов Grp и vir-1. Показано, что наличие активного ретровируса gypsy оказывает более существенное влияние на экспрессию исследуемых генов, чем генетический фон линии SS. Активная копия gypsy вызывает повышение экспрессии STAT-индуцируемых изоформ гена vir-1 и гена Grp у самок только на фоне генотипа линии MS. Таким образом, ген Grp задействован в иммунном ответе, реализуемом через сигнальный путь Jak-STAT. Ген Iris, по-видимому, не участвует в иммунном ответе. 2) Для определения роли генетических факторов в развитии орфанного заболевания - гипогинадотропного гипогонадизма проведено исследование группы пациенток с этим заболеванием и контрольной группы здоровых женщин репродуктивного возраста. Изучено 11 генов кандидатов данного заболевания. Выявлена ассоциированность повышенной экспрессии гена GNRH1 в клетках крови с изолированной формой гипогонадотропного гипогонадизма.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В 2017 году было исследовано влияние окислительного стресса на экспрессию гена Gagr, характер влияния параквата и персульфата аммония на экспрессию Gagr в зависимости от времени воздействия у самцов и самок. Выявлены особенности тканеспецифической активации транскрипции гена Gagr. Была сследована роль различных изоформ транскрипта гена Gagr с альтернативным стартом транскрипции в стресс-индуцируемой активации экспрессии Gagr. Во всех экспериментах исследован уровень транскриптов генов-мишеней стрессовых сигнальных путей — Rel, vir-1, upd3, hid. Исследован характер ответа на окислительный стресс у имаго самок D.melanogaster при нокдауне гена Gagr. Выявлено, что паракват и персульфат аммония вызывают окислительный стресс и активацию гена Gagr. Характер этой активации отличается в зависимости от природы вещества. Относительное повышение экспрессии Gagr более выражено в тканях самок и отсутствует при воздействии параквата у самцов (24 часа 50mM; 48 часов 10mM). Персульфат аммония (0,1M) вызывает активацию транскрипции Gagr более чем через 20 часов после начала воздействия, в то время как другие исследуемые в работе гены ответа на окислительные стресс активируются намного раньше. Показано, что ген Gagr специфически активируется в тканях каркаса при окислительном стрессе, но не в кишке, что также отличает активацию Gagr от таковой для генов upd3, vir-1 и Rel. Показано, что короткая изоформа - транскрипт Gagr-A является не только основным транскриптом, но и подвержен стресс-индуцируемой активации в отличие от длинной изоформы Gagr-B. Экспрессия гена Gagr не меняется под действием газообразным Cl2 и О2. Это может быть связано с тканевой специфичностью участия гена Gagr в ответе на окислительный стресс, а также с отличиями механизма действия повышенной концентрации О2 от эффектов персульфата аммония и менандиона. Установлено, что нокдаун гена Gagr вызывает снижение транскрипции мишени сигнального пути Jak-STAT гена vir-1 (изоформы D и E) и не вызывает изменений в экспрессии мишеней JNK генов Rel и upd при окислительном стрессе.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. Ломоносова имеются линии D. melanogaster с нарушенным контролем транспозиции ретротранспозонов группы gypsy - SS и MS (flamenco-), одна из которых (MS) имеет активную копию gypsy в геноме. Присутствие активных копий МГЭ группы gypsy может прямо или опосредованно нарушать работу других генов. Линия MS (w,flamenco-, gypsy+) характеризуется пониженной продолжительность жизни, сниженной плодовитость, нарушением полового поведения у самцов относительно линий дикого типа (CantonS, Д32). При этом линия MS является отводкой линии SS (w,flamenco-) в которой данных нарушений не наблюдается, отличаясь от исходной наличием активной копии gypsy. Копия расположена в гене forked, что приводит к фенотипу “опаленных щетинок”. Мы провели поиск мутаций (точечных замен нуклеотидов), которые могли бы повлиять на функционирование системы РНК-интерференции, в экзомах линий flamenco-(MS и SS) и линий дикого типа Д-32, CantonS, w1118, OregonR. Для анализа были выбраны гены, участвующие в контроле транспозиции МГЭ. В результате анализа не было обнаружено делеций, вставок, нонсенс-кодонов и других нарушений, которые могут однозначно приводить к изменению функции гена. В линиях flamenco- было обнаружено только пять нуклеотидных замен, которые приводили к замене аминокислоты, отсутствуют в линиях дикого типа и небыли ранее описаны в базах данных. Это замены в генах piwi, tud, CG7504, vret и Nmnat.При поиске мутаций в линии MS в экзоме не были найдены гены, ассоциированные с нарушением продолжительности жизни. Среди фенотипических проявлений, имеющихся в базе данных FlyBase, аллели гена forked так же не связаны с сокращением продолжительности жизни. Гибриды от прямого и обратного скрещивания линий MS и дикого типа Д-32 в F1 имеют сниженную продолжительность жизни только для самцов в обратном скрещивании; в F2 сниженную продолжительность жизни имеют все особи с фенотипом “опаленные щетинки”. Скорее всего, на уменьшение продолжительности жизни в линии MS влияет активная копия gypsy вместе с нарушение процесса подавления её активности. Так как явных нарушений в генах, участвующих в контроле транспозиции МГЭ, найдено не было, то можно предположить: фенотип flamenco- в линиях MS и SS связан с нарушением работы локуса flamenco. Расстояние между локусом flamenco и геном forked на Х хромосоме составляет около 5 сМ. Для получения особей flamenco+ с активной копией gypsy были взяты самки лабораторных линии дикого типа CantonS и самцы линии MS (w,flamenco-, активная копия gypsy). В F2 появляются самцы с фенотипом опаленные щетинки (активной копии gypsy). Только около 2,5% из этих особей имеют фенотип flamenco+ перешедший от линии дикого типа. Визуально фенотипы самцов flamenco- и flamenco+ неотличимы. Для дальнейшего определения фенотипа был использован метод ПЦР в реальном времени.Для получения кДНК и дальнейшего ведения линий необходимо больше самцов с новыми фенотипами. Соответственно самцы с фенотипом опаленные щетинки были индивидуально скрещены с самками линии М5 для поддержания целостности Х хромосомы в последующих поколениях. Всего было сделано 45 индивидуальных скрещиваний самок линии М5 на самцов F2 с фенотипом опаленные щетинки. В поколении F2 были получены самцы с фенотипом опаленные щетинки. Благодаря отсутствию кроссинговера у линии М5, Х хромосома от самцов Р0 (самцов F2 с фенотипом опаленные щетинки, flamenco- или flamenco+) переходит в неизмененном виде к самцам F2. От каждого скрещивания из F2 было взято по 5 особей с фенотипом опаленных щетинок в возрасте 5 дней для получения кДНК согласно протоколу фирмы производителя (Евроген, Россия). Для определения фенотипа flamenco были выбраны гены транспозонов: gypsy, tirant, rover, CR45822, opus. В качестве референсного гена был использован β-актин (actb). Относительная экспрессия генов tirant и rover в лабораторных линиях линий с фенотипом flamenco+ повышена в несколько раз. Соответственно относительная экспрессия транспозонов gypsy, opus и гена CR45822 в лабораторных линиях с фенотипом flamencо+ понижено в несколько раз.С помощью метода количественного ПЦР в реальном времени была измерена относительная экспрессия CR45822 (антисмысловая РНК, транскрибируемая в области гена ctcf) и ретротранспозонов gypsy, tirant, rover, opus у 45 гибридов второго поколения, полученных от скрещивания линии MS (flamenco-, активная копия gypsy в гене forked) и CantonS (flamenco+). При анализе относительной экспрессии всех генов только одна проба повторяла профиль экспрессии контрольной линии с фенотипом flamenco+(CantonS) ретротранспозонов tirant,rover, opus и CR45822,относительно других 44 проб и линий с фенотипом flamenco- (SS). Мухи этой пробы были выведены в чистую линию. Повышенную экспрессию gypsy в данных образцах можно объяснить наличием активной копии gypsy (фенотип всех гибридов - опаленные щетинки (активной копии gypsy)). Анализ уровней транскрипции gypsy, tirant, rover, opus и гена CR45822 в совокупности позволяет различить фенотипы flamenco- и flamenco+. По результатам секвенирования было установлено, что ген DIP1 имеет однонуклеотидную замену характерную для линий MS и SS. Данный ген расположен на расстоянии менее 2 kbp от локуса flamenco. Методом аллель-специфичной ПЦР было установлено, что линия 90К имеет ген DIP1 без мутации, а значит локус flamenco+ , унаследованный от линии дикого типа CantonS.Новая линия 90К имеет фенотип опаленные щетинки (активной копии gypsy в гене forked (линии MS)) и фенотип flamenco+. Продолжительности жизни линии 90К снижена относительно контрольных линий Д-32, CantonS, SS. Можно предположить, что данный параметр связан не только с мутацией в гене forked. Линия имеет активную копию gypsy и локус flamenco от дикого типа, но экспрессия gypsy остается повышенной.Ранее в нашей лаборатории было исследовано in vitro взаимодействие гетерохроматиновых белков семейства HP1 c регуляторными участками ретротранспозонов группы gypsy. Показано, что белки семейства HP1 эффективно связываются с 5'-нетранслируемой областью ретротранспозонов, имеющих в ее составе тандемные повторы. Обнаружено, что повторы абсолютно необходимы для связывания белка HP1a с 5'-нетранслируемой областью и, скорее всего, являются важным инструментом регуляции их транспозиции ретротранспозонов группы gypsy. Условия, подобранные для специфичного связывания in vitro могут отличаться от условий образования ДНК-белковых комплексов с белком HP1a in vivo. С целью проверки взаимодействия белка с нетраслируемой областью МГЭ Tirant in vivo нами разработана биплазмидная модельная система в клетках E.coli с использованием векторов, содержащих репортерный ген GFP, слитый с тандемными повторами 5'-нетранслируемой области ретротранспозона Tirant (pBS:Tir:GFP), и вектора, содержащего полноразмерную копию белка HP1a (pET30::hp1a). В настоящее время проводятся пилотные эксперименты с плазмидой pBS:Tir:GFP. Предполагается, что взаимодействие белка HP1a с тандемными повторами на участке между репортерным геном и индуцируемым lacZ промотором должна снизить уровень экспрессии гена GFP, что подтвердит нашу гипотезу о роли белков HP1 в регуляции активности ретротранспозонов.Далее мы оценивали, как влияет воздействие различных стрессовых факторов, которые нарушают целостность биологических макромолекул (ДНК и белков) и вызывают различные типы стресса, включая ЭПР-стресс. 0.1 М персульфат аммония использовали в качестве индуктора окислительного стресса и анализировали уровень транскриптов гена Gagr (изоформы A и B), vir-1, upd3 иRel, которые использовали в качестве общих стрессовых маркеров, и генов hid, Tspo и sid, которые являются апоптотическими маркерами и кодируют белки, которые выполняют специфические функции в митохондриях при окислительном стрессе. Результаты эксперимента показали два этапа развития окислительного стресса в организме D.melanogaster, вызванного персульфатом аммония. Временная динамика в экспрессии исследуемых генов показывает, что острая фаза стресса наступает после 24-часового воздействия 0.1 М персульфата аммония. Эта фаза характеризуется значительным повышением экспрессии Gagr и генов стрессового ответа (upd3, Rel, vir-1, Hsp22), в этой фазе происходит активация генов проапоптотических маркеров (hid, sid, Tspo), детектируемая на организменном уровне методом количественной ПЦР. Небольшой период восстановления (6 часов) после такого стресса значительно снижает уровень мРНК стресс-индуцируемых факторов до значения небольшой активации относительно базального уровня. До острой фазы стресса (до 24 часов) активируются стресс-индуцируемые гены upd3, Rel, vir-1, Hsp22 и ген Gagr, экспрессиякоторых имеет сходную временную динамику: на ранних этапах независимо от наличия небольшого периода восстановления эти гены остаются активированными на том же уровне. Особенностью временной динамики генов Gagr и Relявляется отсутствие изменения в их активности после длительного периода восстановления (12 часов) после 12 часового воздействия 0.1 М персульфата аммония. После острого окислительного стресса (0.1 М персульфат аммония) уровень мРНК Gagr падает при восстановлении и остается на высоком уровне лишь в первые часы, но остается повышенным относительно интактного контроля. Это справедливо и для других исследуемых генов, за исключением проапоптотических sid и Tspo. Для индукции митохондриального стресса в эксперименте использовался олигомицин. Олигомицин является блокатором АТФ-синтазы и вызывает стресс в митохондриях, который заключается в нарушении импорта белков и нарушении стехиометрического баланса компонентов дыхательного комплекса в органелле. Это приводит к фосфорилированию фактора трансляции eIF2α, подавлению трансляции и активации транскрипционного фактора Atf4 (как при ЭПР-стрессе). В данном эксперименте для индукции митохондриального стресса мы подвергали самок линии дикого типа (CantonS) воздействию 100 μM (путём экспозиции на кормовой среде с олигомицином) в течение 20 часов. В качестве контроля использовались мухи, подвергавшиеся экспозиции на корме с эквивалентным содержанием этанола (т. к. в опыте использовался спиртовой раствор олигомицина). В эксперименте оценивали экспрессию гена Gagrи стресс-индуциремых генов, упомянутых в эксперименте с окислительным стрессом. Эксперимент выявил, что в отличие от общего окислительного стресса, вызванного персульфатом аммония, митохондриальныйстресс, вызванный олигомицином не приводит к активации транскрипции гена Gagr.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".