Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человекаНИР

Molecular-genetic mechanisms of genome instability and mutagenesis in animals and humans

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В 2016 году исследования велись в двух направлениях: 1) исследование роли генов Grp и Iris, доместицированных от ретровирусов, в иммунном ответе дрозофилы; 2) изучению генов, определяющих правильное развитие и функционирование гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы у человека. Исследована экспрессия генов Grp и Iris на уровне транскрипции и трансляции, проведен функциональный анализ этих генов. Выявлена их возрастоспецифичная экспрессия: базальный уровень экспрессии на стадии эмбрионов и личинок и высокий уровень – на стадии имаго. Показано, что оба гена транскрибируются в соматических тканях. Относительно высокая экспрессия гена Grp выявлена в тканях кишечника, а высокая экспрессия гена Iris – в тканях корпуса. Для поиска белковых продуктов генов Grp и Iris, гомологов генов gag и env ретровирусов дрозофилы, поставлена вестерн-гибридизация тотального экстракта белков, выделенных из взрослых особей D. melanogaster с сыворотками первичных антител к белкам Grp и Iris. Показано, что белки Grp и Iris обнаруживаются в мембранной фракции. Выявлено, что присутствие функционального ретровируса gypsy вызывает повышение уровня экспрессии гена Grp в соматических тканях каркаса самок и не оказывает влияния на уровень экспрессии гена Iris. Исследован уроевнь экспрессии генов Iris и Grp у самок линии дикого типа (D-32) в ответ на введение в организм грамположительных и грамотрицательных бактерий.Показано, что ген Grp индуцируется введением в организм B.cereus, а ген Iris не индуцируется бактериальной инфекцией. Исследовано воздействие на экспрессию генов Iris и Grp стрессовых факторов: окислительного стресса, голодания, холодового и теплового шока. Обнаружено повышение уровня экспрессии гена Grp в ответ на голодание у самок D.melanogaster и подавление экспрессии гена Iris в ответ на тепловой шок, окислительный стресс и септическую травму. Получены данные о понижении экспрессии гена Grp в результате инъекции M. luteus. В экспериментах по активации путей иммунного ответа Imd, Toll и Jak-STAT у особей дикого типа были получены данные, указывающие на возможное участие пути Jak-STAT в контроле экспрессии гена Grp. Для выяснения роли сигнального пути Jak- STAT в ответе на ретровирусную инфекцию проведен сравнительный анализ экспрессии генов Grp и vir-1, эффектора пути Jak- STAT. Обнаружен повышенный уровень экспрессии STAT-индуцируемых изоформ vir-1 в линии MS, что, вероятно, связано с вирусной активацией Jak-STAT-сигнального пути. Показано, что ретровирус gypsy активирует гены Grp и vir-1 у самок в каркасе брюшка, каркасе головы и задней кишке. Проведен сравнительный анализ экспрессии генов Grp и vir-1 у гибридов D.melanogaster, полученных от реципрокных скрещиваний линий SS и MS, а также скрещиваний этих линий с линией дикого типа. Выявлено влияние нарушения контроля экспрессии мобильных элементов со стороны локуса flamenco, и влияние присутствия активной копии gypsy на экспрессию генов Grp и vir-1. Показано, что наличие активного ретровируса gypsy оказывает более существенное влияние на экспрессию исследуемых генов, чем генетический фон линии SS. Активная копия gypsy вызывает повышение экспрессии STAT-индуцируемых изоформ гена vir-1 и гена Grp у самок только на фоне генотипа линии MS. Таким образом, ген Grp задействован в иммунном ответе, реализуемом через сигнальный путь Jak-STAT. Ген Iris, по-видимому, не участвует в иммунном ответе. 2) Для определения роли генетических факторов в развитии орфанного заболевания - гипогинадотропного гипогонадизма проведено исследование группы пациенток с этим заболеванием и контрольной группы здоровых женщин репродуктивного возраста. Изучено 11 генов кандидатов данного заболевания. Выявлена ассоциированность повышенной экспрессии гена GNRH1 в клетках крови с изолированной формой гипогонадотропного гипогонадизма.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В 2017 году было исследовано влияние окислительного стресса на экспрессию гена Gagr, характер влияния параквата и персульфата аммония на экспрессию Gagr в зависимости от времени воздействия у самцов и самок. Выявлены особенности тканеспецифической активации транскрипции гена Gagr. Была сследована роль различных изоформ транскрипта гена Gagr с альтернативным стартом транскрипции в стресс-индуцируемой активации экспрессии Gagr. Во всех экспериментах исследован уровень транскриптов генов-мишеней стрессовых сигнальных путей — Rel, vir-1, upd3, hid. Исследован характер ответа на окислительный стресс у имаго самок D.melanogaster при нокдауне гена Gagr. Выявлено, что паракват и персульфат аммония вызывают окислительный стресс и активацию гена Gagr. Характер этой активации отличается в зависимости от природы вещества. Относительное повышение экспрессии Gagr более выражено в тканях самок и отсутствует при воздействии параквата у самцов (24 часа 50mM; 48 часов 10mM). Персульфат аммония (0,1M) вызывает активацию транскрипции Gagr более чем через 20 часов после начала воздействия, в то время как другие исследуемые в работе гены ответа на окислительные стресс активируются намного раньше. Показано, что ген Gagr специфически активируется в тканях каркаса при окислительном стрессе, но не в кишке, что также отличает активацию Gagr от таковой для генов upd3, vir-1 и Rel. Показано, что короткая изоформа - транскрипт Gagr-A является не только основным транскриптом, но и подвержен стресс-индуцируемой активации в отличие от длинной изоформы Gagr-B. Экспрессия гена Gagr не меняется под действием газообразным Cl2 и О2. Это может быть связано с тканевой специфичностью участия гена Gagr в ответе на окислительный стресс, а также с отличиями механизма действия повышенной концентрации О2 от эффектов персульфата аммония и менандиона. Установлено, что нокдаун гена Gagr вызывает снижение транскрипции мишени сигнального пути Jak-STAT гена vir-1 (изоформы D и E) и не вызывает изменений в экспрессии мишеней JNK генов Rel и upd при окислительном стрессе.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. Ломоносова имеются линии D. melanogaster с нарушенным контролем транспозиции ретротранспозонов группы gypsy - SS и MS (flamenco-), одна из которых (MS) имеет активную копию gypsy в геноме. Присутствие активных копий МГЭ группы gypsy может прямо или опосредованно нарушать работу других генов. Линия MS (w,flamenco-, gypsy+) характеризуется пониженной продолжительность жизни, сниженной плодовитость, нарушением полового поведения у самцов относительно линий дикого типа (CantonS, Д32). При этом линия MS является отводкой линии SS (w,flamenco-) в которой данных нарушений не наблюдается, отличаясь от исходной наличием активной копии gypsy. Копия расположена в гене forked, что приводит к фенотипу “опаленных щетинок”. Мы провели поиск мутаций (точечных замен нуклеотидов), которые могли бы повлиять на функционирование системы РНК-интерференции, в экзомах линий flamenco-(MS и SS) и линий дикого типа Д-32, CantonS, w1118, OregonR. Для анализа были выбраны гены, участвующие в контроле транспозиции МГЭ. В результате анализа не было обнаружено делеций, вставок, нонсенс-кодонов и других нарушений, которые могут однозначно приводить к изменению функции гена. В линиях flamenco- было обнаружено только пять нуклеотидных замен, которые приводили к замене аминокислоты, отсутствуют в линиях дикого типа и небыли ранее описаны в базах данных. Это замены в генах piwi, tud, CG7504, vret и Nmnat.При поиске мутаций в линии MS в экзоме не были найдены гены, ассоциированные с нарушением продолжительности жизни. Среди фенотипических проявлений, имеющихся в базе данных FlyBase, аллели гена forked так же не связаны с сокращением продолжительности жизни. Гибриды от прямого и обратного скрещивания линий MS и дикого типа Д-32 в F1 имеют сниженную продолжительность жизни только для самцов в обратном скрещивании; в F2 сниженную продолжительность жизни имеют все особи с фенотипом “опаленные щетинки”. Скорее всего, на уменьшение продолжительности жизни в линии MS влияет активная копия gypsy вместе с нарушение процесса подавления её активности. Так как явных нарушений в генах, участвующих в контроле транспозиции МГЭ, найдено не было, то можно предположить: фенотип flamenco- в линиях MS и SS связан с нарушением работы локуса flamenco. Расстояние между локусом flamenco и геном forked на Х хромосоме составляет около 5 сМ. Для получения особей flamenco+ с активной копией gypsy были взяты самки лабораторных линии дикого типа CantonS и самцы линии MS (w,flamenco-, активная копия gypsy). В F2 появляются самцы с фенотипом опаленные щетинки (активной копии gypsy). Только около 2,5% из этих особей имеют фенотип flamenco+ перешедший от линии дикого типа. Визуально фенотипы самцов flamenco- и flamenco+ неотличимы. Для дальнейшего определения фенотипа был использован метод ПЦР в реальном времени.Для получения кДНК и дальнейшего ведения линий необходимо больше самцов с новыми фенотипами. Соответственно самцы с фенотипом опаленные щетинки были индивидуально скрещены с самками линии М5 для поддержания целостности Х хромосомы в последующих поколениях. Всего было сделано 45 индивидуальных скрещиваний самок линии М5 на самцов F2 с фенотипом опаленные щетинки. В поколении F2 были получены самцы с фенотипом опаленные щетинки. Благодаря отсутствию кроссинговера у линии М5, Х хромосома от самцов Р0 (самцов F2 с фенотипом опаленные щетинки, flamenco- или flamenco+) переходит в неизмененном виде к самцам F2. От каждого скрещивания из F2 было взято по 5 особей с фенотипом опаленных щетинок в возрасте 5 дней для получения кДНК согласно протоколу фирмы производителя (Евроген, Россия). Для определения фенотипа flamenco были выбраны гены транспозонов: gypsy, tirant, rover, CR45822, opus. В качестве референсного гена был использован β-актин (actb). Относительная экспрессия генов tirant и rover в лабораторных линиях линий с фенотипом flamenco+ повышена в несколько раз. Соответственно относительная экспрессия транспозонов gypsy, opus и гена CR45822 в лабораторных линиях с фенотипом flamencо+ понижено в несколько раз.С помощью метода количественного ПЦР в реальном времени была измерена относительная экспрессия CR45822 (антисмысловая РНК, транскрибируемая в области гена ctcf) и ретротранспозонов gypsy, tirant, rover, opus у 45 гибридов второго поколения, полученных от скрещивания линии MS (flamenco-, активная копия gypsy в гене forked) и CantonS (flamenco+). При анализе относительной экспрессии всех генов только одна проба повторяла профиль экспрессии контрольной линии с фенотипом flamenco+(CantonS) ретротранспозонов tirant,rover, opus и CR45822,относительно других 44 проб и линий с фенотипом flamenco- (SS). Мухи этой пробы были выведены в чистую линию. Повышенную экспрессию gypsy в данных образцах можно объяснить наличием активной копии gypsy (фенотип всех гибридов - опаленные щетинки (активной копии gypsy)). Анализ уровней транскрипции gypsy, tirant, rover, opus и гена CR45822 в совокупности позволяет различить фенотипы flamenco- и flamenco+. По результатам секвенирования было установлено, что ген DIP1 имеет однонуклеотидную замену характерную для линий MS и SS. Данный ген расположен на расстоянии менее 2 kbp от локуса flamenco. Методом аллель-специфичной ПЦР было установлено, что линия 90К имеет ген DIP1 без мутации, а значит локус flamenco+ , унаследованный от линии дикого типа CantonS.Новая линия 90К имеет фенотип опаленные щетинки (активной копии gypsy в гене forked (линии MS)) и фенотип flamenco+. Продолжительности жизни линии 90К снижена относительно контрольных линий Д-32, CantonS, SS. Можно предположить, что данный параметр связан не только с мутацией в гене forked. Линия имеет активную копию gypsy и локус flamenco от дикого типа, но экспрессия gypsy остается повышенной.Ранее в нашей лаборатории было исследовано in vitro взаимодействие гетерохроматиновых белков семейства HP1 c регуляторными участками ретротранспозонов группы gypsy. Показано, что белки семейства HP1 эффективно связываются с 5'-нетранслируемой областью ретротранспозонов, имеющих в ее составе тандемные повторы. Обнаружено, что повторы абсолютно необходимы для связывания белка HP1a с 5'-нетранслируемой областью и, скорее всего, являются важным инструментом регуляции их транспозиции ретротранспозонов группы gypsy. Условия, подобранные для специфичного связывания in vitro могут отличаться от условий образования ДНК-белковых комплексов с белком HP1a in vivo. С целью проверки взаимодействия белка с нетраслируемой областью МГЭ Tirant in vivo нами разработана биплазмидная модельная система в клетках E.coli с использованием векторов, содержащих репортерный ген GFP, слитый с тандемными повторами 5'-нетранслируемой области ретротранспозона Tirant (pBS:Tir:GFP), и вектора, содержащего полноразмерную копию белка HP1a (pET30::hp1a). В настоящее время проводятся пилотные эксперименты с плазмидой pBS:Tir:GFP. Предполагается, что взаимодействие белка HP1a с тандемными повторами на участке между репортерным геном и индуцируемым lacZ промотором должна снизить уровень экспрессии гена GFP, что подтвердит нашу гипотезу о роли белков HP1 в регуляции активности ретротранспозонов.Далее мы оценивали, как влияет воздействие различных стрессовых факторов, которые нарушают целостность биологических макромолекул (ДНК и белков) и вызывают различные типы стресса, включая ЭПР-стресс. 0.1 М персульфат аммония использовали в качестве индуктора окислительного стресса и анализировали уровень транскриптов гена Gagr (изоформы A и B), vir-1, upd3 иRel, которые использовали в качестве общих стрессовых маркеров, и генов hid, Tspo и sid, которые являются апоптотическими маркерами и кодируют белки, которые выполняют специфические функции в митохондриях при окислительном стрессе. Результаты эксперимента показали два этапа развития окислительного стресса в организме D.melanogaster, вызванного персульфатом аммония. Временная динамика в экспрессии исследуемых генов показывает, что острая фаза стресса наступает после 24-часового воздействия 0.1 М персульфата аммония. Эта фаза характеризуется значительным повышением экспрессии Gagr и генов стрессового ответа (upd3, Rel, vir-1, Hsp22), в этой фазе происходит активация генов проапоптотических маркеров (hid, sid, Tspo), детектируемая на организменном уровне методом количественной ПЦР. Небольшой период восстановления (6 часов) после такого стресса значительно снижает уровень мРНК стресс-индуцируемых факторов до значения небольшой активации относительно базального уровня. До острой фазы стресса (до 24 часов) активируются стресс-индуцируемые гены upd3, Rel, vir-1, Hsp22 и ген Gagr, экспрессиякоторых имеет сходную временную динамику: на ранних этапах независимо от наличия небольшого периода восстановления эти гены остаются активированными на том же уровне. Особенностью временной динамики генов Gagr и Relявляется отсутствие изменения в их активности после длительного периода восстановления (12 часов) после 12 часового воздействия 0.1 М персульфата аммония. После острого окислительного стресса (0.1 М персульфат аммония) уровень мРНК Gagr падает при восстановлении и остается на высоком уровне лишь в первые часы, но остается повышенным относительно интактного контроля. Это справедливо и для других исследуемых генов, за исключением проапоптотических sid и Tspo. Для индукции митохондриального стресса в эксперименте использовался олигомицин. Олигомицин является блокатором АТФ-синтазы и вызывает стресс в митохондриях, который заключается в нарушении импорта белков и нарушении стехиометрического баланса компонентов дыхательного комплекса в органелле. Это приводит к фосфорилированию фактора трансляции eIF2α, подавлению трансляции и активации транскрипционного фактора Atf4 (как при ЭПР-стрессе). В данном эксперименте для индукции митохондриального стресса мы подвергали самок линии дикого типа (CantonS) воздействию 100 μM (путём экспозиции на кормовой среде с олигомицином) в течение 20 часов. В качестве контроля использовались мухи, подвергавшиеся экспозиции на корме с эквивалентным содержанием этанола (т. к. в опыте использовался спиртовой раствор олигомицина). В эксперименте оценивали экспрессию гена Gagrи стресс-индуциремых генов, упомянутых в эксперименте с окислительным стрессом. Эксперимент выявил, что в отличие от общего окислительного стресса, вызванного персульфатом аммония, митохондриальныйстресс, вызванный олигомицином не приводит к активации транскрипции гена Gagr.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа: В коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ им. Ломоносова имеются линии D. melanogaster с нарушенным контролем транспозиции ретротранспозонов группы gypsy - SS и MS (flamenco-), одна из которых (MS) имеет активную копию gypsy в геноме. Присутствие активных копий МГЭ группы gypsy может прямо или опосредованно нарушать работу других генов. Линия MS (w,flamenco-, gypsy+) характеризуется пониженной продолжительность жизни, сниженной плодовитость, нарушением полового поведения у самцов относительно линий дикого типа (CantonS, Д32). При этом линия MS является отводкой линии SS (w,flamenco-) в которой данных нарушений не наблюдается, отличаясь от исходной наличием активной копии gypsy (Kim et al., 1994). Копия расположена в гене forked, что приводит к фенотипу “опаленных щетинок”. Мы провели оценку фертильности линии MS в сравнении с контрольными линиями: родительской линией SS с нарушенным контролем транспозиции МГЭ, линией w1 и линией дикого типа Д-32. В эксперименте оценивали количество потомства, произведенное одной самкой в течение первых семи дней стадии имаго. Обнаружено, что фертильность линии MS ниже, чем у контрольных линий. При этом особи линии MS оказались гетерогенны по исследуемому признаку, так как выборка включала пары с пониженной фертильностью, а также пары с нормальной фертильностью или бесплодные пары (около 20%). Всего около 30-35% пар мух линии MS за семь дней эксперимента не дали потомства или дали в 5-8 раз меньше, чем в среднем у контрольных линий. Ежедневно от момента подсадки самца к виргинной самке, одна самка линии MS откладывает от 0 до 12 яиц. При этом динамика откладывания яиц некоторых самок линии MS отличается от контрольных линий. Для самок контрольных линий наблюдается увеличение количества откладываемых яиц с возрастом самки, с постепенным выходом на плато и последующем снижением под конец жизни особи. Для самок линии MS корреляции между количеством отложенных яиц и возрастом самки не наблюдается. При этом смертность на эмбриональных и личиночных стадиях для мух линии MS составляет около 3%, что соответствует смертности у мух дикого типа. Чтобы выяснить, с каким из полов связано снижение репродуктивных способностей линии MS, мы проводили реципрокные скрещивания мух линии MS с мухами линий SS и Д-32 и оценивали количество потомства, произведенного одной самкой в течение первых семи дней стадии имаго. Выявлено, что низкая плодовитость у самок линии MS не зависит от партнера для спаривания. В свою очередь, скрещивание самцов линии MS с самками других линий не приводит к значимому снижению плодовитости. Таким образом, низкая плодовитость линии MS определяется, прежде всего, самками. Вместе с тем нельзя исключать нарушения в половом поведении самцов. Поэтому далее проводили сравнительный анализ полового поведения самцов исследуемых линий. Чтобы исключить влияние нарушения зрения на половое поведение самцов, в качестве дополнительного контроля была использована линия w1. Линии с фенотипом flamenco (линии SS и MS) и w1 мутанты по гену white. Анализ полового поведения чистых линий MS, SS, w1 и Д-32 показал отличия в активности самцов. Обнаружено, что все линии, мутантные по гену white, демонстрируют сниженную половую активность по сравнению с особями дикого типа. Предположительно, это связано с нарушением у самцов визуального восприятия самки. Для самцов линий SS и MS наблюдается сходная половая активность, что можно объяснить изогенным происхождением линии. При этом нарушенное половое поведение самцов линии MS не влияет на плодовитость пары при скрещивании с самками других линий. Таким образом, можно заключить, что снижение плодовитости линии MS связано с самками. Для объяснения низкой плодовитости самок была исследована морфология яичников у линии MS. Вскрытие самок и анализ яичников показали гетерогенность внутри линии и различия по сравнению с контрольными линиями SS и Д-32, а так же гибридами первого поколения при скрещивании линии MS с контрольными линиями. Самок в возрасте 7 дней линии MS можно разделить на три группы. Самки первой группы имели нормальную пару яичников: яичники крупные, в обоих яичниках сформированные яйца от 4 до 8, видны стадии оогенеза. Самки второй группы обладали полностью сформированными яичниками, но с ограниченным числом зрелых яиц до 3-х. Самки третьей группы имели сформированные яичники без яиц, внешне похожие на яичники самок возрастом от 1-го дня, но в вагине у некоторых особей найдено одно зрелое яйцо. Контрольные линии SS и Д-32 и гибриды первого поколения от линии MS имели крупные яичники с сформированными зрелыми яйцами в количестве от 4 до 10. Самки F1 от скрещивания ♀MS*♂SS и ♀MS*♂Д32 имели крупные яичники со зрелыми яйцами от 2-х до 6 штук. Пр иммунохимическом окрашиванием яичников самок линии MS были выявлены комплексные нарушения морфологии яичников относительно контрольной линии: дефекты фолликулярного слоя, кольцевых каналов, деградация трофоцитов. Ранее было показано, что инсерция gypsy в линии MS локализована в гене forked, расположенном на Х-хромосоме. Линия гомозиготна по инсерции и, следовательно, по мутации forked. Для того чтобы определить роль мутации в гене forked в нарушении плодовитости, мы провели скрещивания самок линии MS с самцами линий Д-32 и SS. При скрещивании ♀MS*♂Д-32/♂SS в F2 наблюдается расщепление самок 1:1 по фенотипу forked. В случае сохранения нарушения плодовитости у самок с генотипом forked/forked в F2, можно было бы предположить, что сниженная плодовитость определяется мутацией в гене forked. Всего было проанализировано 156 самок F2 с фенотипом forked (1/4 потомства). Самки F2 были использованы в скрещиваниях с самцами дикого типа для анализа количества потомства. В результате анализа мы не обнаружили нарушения в репродуктивных способностях ни у одной из исследованных самок F2 c генотипом forked/forked относительно контрольных линий. Это указывает на то, что признак сниженной фертильности у линии MS либо контролируется несколькими, не менее чем четырьмя, рецессивными аллелями независимо наследующихся генов, взаимодействующих по типу полимерии, либо не подчиняется закономерностям Менделя. Для поиска генетических маркеров, обусловливающих нарушение репродуктивности линии MS, было проведено исследование транскриптомов мух линий SS, MS и Д-32. Мы провели поиск мутаций в экзомах секвенированных нами линий flamenco, которые могли бы повлиять на функционирование системы РНК-интерференции. В предыдущих исследованиях было показано, что в линиях SS и MS с фенотипом flamenco транскрипция основных генов-участников системы РНК-интерференции не изменена, тем не менее, это не исключало возможности нарушения экспрессии генов на уровне белка. В анализ взяли 89 генов, участвующих в РНК-интерференции, ни в одном из которых не было обнаружено замен, которые могли бы иметь функциональное значение. В изогенных линиях SS и MS анализ данных транскриптома самок показал совпадение аминокислотных замен 96% относительно референсного генома BDGP6. При этом в линии MS не обнаружено делеций, вставок, нонсенс-кодонов и однонуклеотидных замен, приводящих к замене аминокислоты относительно линии SS. В результате сравнительного анализа транскриптомов линий MS и SS обнаружены различия в экспрессии 93 генов, из которых экспрессия 51 гена снижена у линии MS в сравнении с линией SS. Функциональный анализ выявил категории генов, вовлеченных в формирование хориона и вителлиновой мембраны. При этом гены, аннотированные этими категориями, имели пониженный уровень экспрессии у особей линии MS. Чтобы оценить, является ли снижение экспрессии общей тенденцией для всех генов, кодирующих белки оболочки яйца у самок линии MS, был использован набор из 40 генов, кодирующих белки хориона и специфически экспрессирующихся на разных стадиях развития поздних фолликул. Оказалось, что у линии MS экспрессия всех 40 генов снижена относительно линии SS (у большинства генов значимо) по результатам секвенирования транскриптома. Результаты РНК-секвенирования были подтверждены для отдельных генов с помощью количественной ПЦР. В первую очередь, мы исследовали экспрессию генов со специфической экспрессией в фолликулярных клетках яичников у индивидуальных самок линий SS и MS. Это гены Vm26Aa, psd, Fcp3C, CG14309, которые экспрессируются на стадиях S9-S10 в фолликулярных клетках и Cp16 со специфической экспрессией на стадии S14. В результате анализа 20 самок каждой из линий были обнаружены значимые различия в уровне транскрипта между линиями для всех исследуемых генов за исключением Fcp3C. Обнаружено, что уровень мРНК этих генов, как правило, намного ниже у самок линии MS, при этом наблюдалась значительная вариабельность уровня экспрессии среди особей исследуемых линий. Среди других генов, демонстрирующих высокую вариабельность в экспрессии у самок, оказались phu и tobi, которые экспрессируются и у самцов, и у самок в различных тканях. Ген phu является геном фосфатазы, экспрессия которого подавляется условиями голодания и различными стрессовыми воздействиями: окислительными агентами, условиями гипероксии, рентгеновским излучением, в свою очередь, tobi вовлечен в регуляцию углеводного обмена и индуцируется условиями голодания. У самок линии MS мы наблюдали снижение экспрессии гена phu и повышение - для гена tobi, у самцов этого не наблюдалось. Для подтверждения транспозиционной активности МГЭ gypsy у самок линии MS и у гибридных самок F2 с генотипом forked/forked был проведен ovoD-тест — система скрещиваний, направленных на выявление перемещения МГЭ в линиях дрозофилы. Тест основан на использовании доминантной мутации женской стерильности ovoD, локализованной в Х- хромосоме и вызывающей атрофию обоих яичников у самок. Локус ovoD - это «горячая точка» инсерции gypsy, в случае инсерции gypsy в локус ovoD происходит реверсия мутации стерильности и восстановление фертильности у гетерозиготных по мутации самок. Самцов линии ovoD1 скрещивали с виргинными самками линий дикого типа, MS и самками второго поколения c генотипом forked/forked и проводили анализ яичников у самок из полученного потомства. При анализе мы учитывали, что причиной появления фертильных самок в потомстве ovoD1 может быть и митотический кроссинговер (частота составляет не более 0,5%), в результате которого половые клетки лишаются аллеля ovoD. Следовательно, если число фертильных самок в потомстве превышает 0,5%, то исследуемую линию можно считать генетически нестабильной. Для линии дикого типа восстановление фертильности произошло только у одной самки из 547, что составляет менее 0,5% реверсий локуса ovoD1. Для линии MS данный показатель составил 1% (6 самок с яичником из 584 проанализированных самок), следовательно, исследуемую линию можно считать генетически нестабильной. Для самок второго поколения, содержащих в гомозиготном состоянии активною копию gypsy, также как и в родительской линии MS, показатель реверсии локуса ovoD1 составил 2,1% (12 самок с яичником из 571 проанализированных самок). Таким образом, низкая фертильность самок MS обусловлена нарушениями процесса оогенеза. Известно, что линия MS характеризуется инсерцией gypsy в ген forked. но в научной литературе нет информации о том, что ген forked может быть задействован в оогенезе. Сравнительный анализ транскриптомов линий MS и SS показал практически полное совпадение аминокислотных замен. При этом в линии MS не обнаружено мутаций (стоп-кодонов, делеций, инсерций) в белок-кодирующих генах, которые бы отличали эту линию от линии SS. Конечно, следует учитывать, что мы проанализировали только часть генов (которые экспрессируются на стадии имаго), также мы не анализировали некодирующие РНК. В результате анализа транскриптома обнаружены различия в экспрессии 93 генов, из которых экспрессия 51 гена снижена у линии MS в сравнении с линией SS. Функциональный анализ выявил категории генов, вовлеченных в формирование хориона и вителлиновой мембраны. При этом гены, аннотированные этими категориями, имеют пониженный уровень экспрессии у самок линии MS. Транскриптомные данные отражают комплексное нарушение стадий позднего оогенеза — вителлогенеза и формирования хориона. Причинами этого нарушения могут быть как дефекты предшествующих стадий оогенеза, так и некорректная работа механизмов, обеспечивающих созревание ооцита. Дифференцировка фолликулярных клеток, продукция белков оболочек, содержание белка и липидов в ооцитах зависит от многих сигнальных механизмов и гуморальных стимулов. Анализ уровня мРНК генов, участвующих в вителлогенезе (Cp16, Fcp3C, psd, Vm26Aa, CG14309) у индивидуальных особей показал, что самки линии MS имеют вариабельный профиль экспрессии. Таким образом, нарушения поздних стадий оогенеза, вероятно, не имеет систематический характер и проявляется по-разному. Среди генов, которые имеют повышенный, но вариабельный уровень экспрессии у самок MS, tobi и phu. Ген гликозидазы tobi является регулятором углеводного обмена, его оверэкспрессия приводит к увеличению запасов гликогена и подавлению роста у личинок, также его экспрессия регулируется в зависимости от статуса питания (подавляется при избытке сахаров или недостатке белка). В свою очередь, экспрессиия гена phu значительно зависит от потребления сахаров . Предположительно, изменение экспрессии tobi и углеводного обмена у самок линии MS относительно контрольной линии может влиять на репродуктивность, либо является компенсаторным механизмом для поддержания необходимого уровня гликогена в ооцитах. Роль генов Ggt-1 и CG3397, для которых мы обнаружили значительно пониженный уровень экспрессии у всех самок MS, в оогенезе и репродуктивности не ясна и требует изучения. Таким образом, снижение фертильности самок линии MS может быть либо следствием повышенной транспозиционной активности МГЭ gypsy, способствующей генетической нестабильности в линии MS, либо следствием случайных процессов, например дрейфа генов, способствующих накоплению сразу нескольких (не менее четырех) рецессивных мутаций в генах, контролирующих оогенез. Результаты опубликованы в работах: [1] Ким А. И., Нефедова Л. Н. ВОЗНИКНОВЕНИЕ ВИРУСОВ И ЭВОЛЮЦИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ И КЛЕТОК // МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС VII СЪЕЗД ВАВИЛОВСКОГО ОБЩЕСТВА ГЕНЕТИКОВ И СЕЛЕКЦИОНЕРОВ, ПОСВЯЩЕННЫЙ 100-ЛЕТИЮ КАФЕДРЫ ГЕНЕТИКИ СПБГУ, И АССОЦИИРОВАННЫЕ СИМПОЗИУМЫ 18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург, Россия. — Издательство ВВМ (WM Publishing Ltd.) Санкт-Петербург, 2019. — С. 203–203. [2] ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ДОМЕСТИЦИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В СТРЕССОВОМ ОТВЕТЕ У drosophila melanogaster / Л. Н. Нефедова, П. А. Махновский, Е. И. Балакирева и др. // МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС VII СЪЕЗД ВАВИЛОВСКОГО ОБЩЕСТВА ГЕНЕТИКОВ И СЕЛЕКЦИОНЕРОВ, ПОСВЯЩЕННЫЙ 100-ЛЕТИЮ КАФЕДРЫ ГЕНЕТИКИ СПБГУ, И АССОЦИИРОВАННЫЕ СИМПОЗИУМЫ 18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург, Россия. — Издательство ВВМ (WM Publishing Ltd.) Санкт-Петербург, 2019. — С. 470–470. [3] Кукушкина И. В., Тарасова А. Исследование мутации forked, вызванной инсерцией ретротранспозона gypsy у дрозофил с нарушенным конторолем транспозиции ретроэлементов // Материалы Международного молодежного научного форума ЛОМОНОСОВ-2019 / Под ред. Е. С. Каширина, В. В. Хапаев, Э. Р. Шихаметова. — Т. 1. — Москва: Москва, 2019. [4] Кукушкина И. В., Тарасова А. А., Нефедова Л. Н. ВЛИЯНИЕ АКТИВНОСТИ МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ НА КАЧЕСТВО И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ ОРГАНИЗМА // Клиническая геронтология. — 2019. — Т. 25, № 9-10. — С. 54–54. [5] Разработка нового метода мониторинга нестабильности генома в ответ на химический стресс / А. Р. Лавренов, В. С. Румак, E. С. Левенкова и др. // Сборник тезисов Международного конгресса "VII съезд ВОГиС, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУб и ассоциированные симпозиумы" (18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург, Россия). Научное электронное издание. — Изд. BBM (WM Publishing Ltd Санкт-Петербург, 2019. — С. 519.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Молекулярно-генетические механизмы нестабильности генома и мутагенеза у животных и человека
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".