МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА БИОНАНОСТРУКТУРНИР

Mechanism of intracellular transport of bionanostructures.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА БИОНАНОСТРУКТУР
Результаты этапа: Тема: Изучение структурных и функциональных изменений клеток корней проростков пшеницы Triticum aestivum L. при действии ингибитора полимеризации актиновых филаментов латрункулина В. В ходе исследования были получены следующие данные: 1. Инкубация проростков с латрункулином В в течение 3 часов. 1.1. Микротрубочки. В популяции интерфазных клеток присутствовали клетки с типичной организацией кортикальной сети микротрубочек, а также клетки с сильно прореженными кортикальными пучками, с неоднородными по плотности пучками, с хаотически ориентированными пучками. В конце G2 фазы и профазе была нарушена латеральная ассоциация микротрубочек в препрофазном кольце, а также присутствовали многочисленные центры схождения микротрубочек вблизи ядерной оболочки. На остальных стадиях митоза нарушений не наблюдалось. 1.2. Изучение ультраструктуры выявило в цитоплазме клеток многочисленные вакуоли с различным содержимым и жировые капли. Стопки аппарата Гольджи имели типичную структуру. В цитоплазме некоторых клеток присутствовали атипичные рыхлые аморфные тяжи, а также свернутые в клубки филаменты. 2. Инкубация проростков с латрункулином В в течение 6 часов. 2.2. Микротрубочки. Среди интерфазных клеток были выявлены те же изменения системы микротрубочек, которые регистрировались ранее. В профазных клетках были обнаружены многополюсные профазные веретена. Кроме этого, были выявлены клетки с ассиметричным положением ядра в области препрофазного кольца, и фрагментированным фрагмопластом в телофазе. 2.3. Анализ ультраструктуры показал присутствие в цитоплазме многочисленных вакуолей с различным содержимым и жировых капель, расположенных вблизи стопок аппарата Гольджи. Последние были окружены многочисленными везикулами. В цитоплазме многих клеток также выявлялись рыхлые аморфные тяжи и клубки филаментов. 3. Инкубация проростков с латрункулином В в течение 12 часов. 3.1. Микротрубочки. Среди интерфазных клеток были выявлены те же изменения системы микротрубочек, которые наблюдали ранее. 3.2. Изучение ультраструктуры выявило в цитоплазме клеток: многочисленные вакуоли, стопки апппарата Гольджи, окруженные множеством мелких везикул, нетипичные гигантские митохондрии, рыхлые аморфные тяжи, плотные пучки филаментов, клубки филаментов внутри вакуолей. 4. Инкубация проростков с латрункулином В в течение 24 часов. 4.1. Микротрубочки. Для интерфазных клеток были характерны такие же изменения системы кортикальных микротрубочек, которые регистрировались ранее. В телофазе и цитокинезе отмечалось неравномерное деление цитоплазмы. 4.2. Изучение ультраструктуры выявило присутствие многочисленных вакуолей, инвагинации поверхности многих клеток, стопки аппарата Гольджи, окруженные множеством везикул, гигантские митохондрии, рыхлые аморфные тяжи, клубки филаментов, плотные пучки из тонких филаментов. Тема: Сравнительный анализ реакции нормальных и трансформированных культивируемых клеток человека эпителиального и соединительнотканного происхождения на действие растительных гормонов. 1. Схема проведения эксперимента состояла из 3 этапов: 1) однократное добавление агента жасмоновой кислоты или метилжасмоната (ЖК или МЖ) с последующей оценкой жизнеспособности через 24, 48 и 72 часа после начала инкубации; 2) однократное добавление агента (ЖК или МЖ) на 24 часа, замена на кондиционированную среду без агента (отмывка) и оценка жизнеспособности через 24 часа (всего 48 часов инкубации) и 48 часов (всего 72 часа инкубации); 3) добавление агента (ЖК или МЖ) на 24 часа, затем удаление среды и добавление такой же концентрации агента в кондиционированной среде с оценкой жизнеспособности клеток через 24 часа (всего 48 часов инкубации), затем удаление среды и добавление такой же концентрации агента в кондиционированной среде и оценкой жизнеспособности клеток через 24 часа (всего 72 часа инкубации). 1.1. Клетки линии HaCaT. Однократное добавление ЖК вызывало снижение жизнеспособности клеточной популяции на 15,8% через 24 часа после начала инкубации; однако, через 48 часов и 72 часа снижения жизнеспособности не наблюдалось. Однократное добавление МЖ приводило к снижению жизнеспособности на 70% через 24 часа; и эффект сохранялся через 48 часов и 72 часа, т.е. однократной дозы МЖ было достаточно для поддержания длительного эффекта. После отмывки ЖК мы не выявили изменений в жизнеспособности клеток. Однако после отмывки МЖ эффект снижения жизнеспособности клеток сохранялся - на 55,5% через 48 часов и на 62% через 72 часа инкубации. Ежедневное добавление ЖК в кондиционированной среде показало, что жизнеспособность клеток снижалась на 26,5% через 48 часов и на 34,8% через 72 часа, т.е. в целом влияние ЖК на жизнеспособность было выражено более ярко, чем через 24 часа. Таким образом, для поддержания влияния ЖК на жизнеспособность данных клеток требуется ее многократное применение. При ежедневном добавлении МЖ снижение жизнеспособности через 48 часов и 72 часа составляло 77,7% и 65,5% соответственно, то есть оставалось на том же уровне, что и через 24 часа. Это также свидетельствует в пользу того, что для поддержания длительного снижения жизнеспособности достаточно однократного применения МЖ. 1.2. Клетки линии А431. Однократное добавление ЖК вызывало снижение жизнеспособности клеточной популяции на 11,6% через 24 часа; через 48 часов и 72 часа эффект возрастал до 28,8% и 21,2% соответственно. Однократное добавление МЖ приводило к снижению жизнеспособности на 51,5% через 24 часа; эффект сохранялся через 48 и 72 часа. Следовательно, для поддержания длительного эффекта в клетках данной линии достаточно применения однократной дозы ЖК или МЖ. После отмывки ЖК снижения жизнеспособности клеток не наблюдалось. После отмывки МЖ снижения жизнеспособности наблюдалось только через 72 часа инкубации (58% клеток). Ежедневное добавление ЖК в кондиционированной среде приводило к снижению жизнеспособности на 36,8 % через 48 часов и на 41,7 % через 72 часа. При ежедневном добавлении МЖ снижение жизнеспособности через 48 часов и 72 часа составляло 77,2% и 80% соответственно. 1.3. Клетки линии 1036. Подкожные фибробласты человека линии 1036 оказались не чувствительны к действию ЖК и МЖ. Снижение жизнеспособности было зафиксировано только через 72 часа инкубации с МЖ. 1.4. Клетки линии НТ1080. При однократном добавлении ЖК к клеткам фибросаркомы человека линии НТ1080 происходило снижение жизнеспособности клеточной популяции на 13,3% через 24 часа, на 14,5% через 48 часов и 24,6% через 72 часа. Однократное добавление МЖ приводило к снижению жизнеспособности на 56,2% через 24 часа; на 56,8% через 48 часов и 63,2% через 72 часа. Следовательно, для поддержания длительного эффекта в этих клетках достаточно применения однократной дозы ЖК или МЖ. После отмывки ЖК эффект снижения жизнеспособности клеток не сохранялся. После отмывки МЖ через 48 и 72 часа наблюдалось снижение жизнеспособности на 49,1% и 32,6% соответственно, т.е. эффект был выражен хуже, чем через 24 часа. Ежедневное добавление ЖК в кондиционированной среде приводило к снижению жизнеспособности на 21,6% через 48 часов и 37,4% через 72 часа. При ежедневном добавлении МЖ снижение жизнеспособности через 48 часов и 72 часа составляло 60,7% и 81,2% соответственно. 2. В связи с тем, что МЖ вызывает значительное снижение жизнеспособности опухолевых клеток и кератиноцитов линии HaCaT, мы определили тип клеточной гибели через 24 часа инкубации с МЖ в клетках НаСаТ, А431 и НТ1080 с помощью проточной цитофлуориметрии. 2.1. В кератиноцитах линии НаСаТ доля живых клеток составляла 86,2%, некротических клеток - 1,5%, апоптотических клеток – 4,3%, постапоптотических некрозов – 8%. Воздействие МЖ на клетки НаСаТ приводило к уменьшению доли живых клеток до 52,6%, возрастанию доли некрозов до 3,3%, возрастанию апоптозов и постапоптотических некрозов до 28,9% и 15,2% соответственно. Следовательно, МЖ вызывает гибель клеток линии НаСаТ по апоптотическому пути. 2.2. В клетках эпидермоидной карциномы А431 доля живых клеток составляла 94,4%, некротических, апоптотических и постапоптотических - 2,1%, 2,3% и 2,3% соответственно. После инкубации с МЖ доля живых клеток снизилась до 0,9%, доля некрозов составляла 0,4%, апоптозов – 13,2%, постапоптотических некрозов – 85,5%. Следовательно, МЖ вызывает гибель клеток линии А431 по апоптотическому пути. 2.3. В клетках фибросаркомы НТ1080 доля живых клеток составляла 95,9%, некрозов, апоптозов и постапоптотических некрозов - 0,1%, 2,2% и 1,8% соответственно. Воздействие МЖ на клетки НТ1080 приводило к уменьшению доли живых клеток до 35,7%, возрастанию некрозов до 60,5%, ранних стадий апоптоза выявлено не было, а доля постапоптотических некрозов была 3,7%. Эти данные свидетельствует о том, что в данной клеточной линии МЖ вызывает некротическую гибель. 3. В связи с тем, что в механизме запуска апоптоза ключевую роль могут играть митохондрии, а для некоторых опухолевых клеточных линий, в присутствии жасмонатов показан митохондриальный путь апоптоза, мы исследовали состояние митохондриальной сети с помощью двойного окрашивания прижизненными маркерами MitoТracker Green FM (окрашивает все митохондрии) и MitoTracker Orange (потенциал-зависимый краситель, выявляющий активные митохондрии). 3.1. Воздействие ЖК и МЖ на клетки линии НаСаТ приводило к увеличению количества неактивных митохондрий по сравнению с контролем. Воздействие ЖК на клетки линии А431 вызывало незначительное снижение количества активных митохондрий по сравнению с контролем. После инкубации с МЖ выявлялись только погибшие клетки с неактивными митохондриями. Таким образом, ЖК оказывала влияние на хондриом как нормальных, так и опухолевых кератиноцитов, снижая количество активных митохондрий. При действии МЖ большая часть клеточной популяции обеих линий оказывалась нежизнеспособной, а в оставшихся клетках митохондриальная сеть выявлялась плохо. 3.2. После инкубации клеток линии 1036 с ЖК, только определенные зоны митохондриальной сети (например, митохондрии в околоядерной области), были инактивированы, а после инкубации с МЖ подавляющее число митохондрий переходило в неактивное состояние. Инкубация клеток линии НТ1080 с ЖК не приводила к снижению активности митохондриальной сети. После инкубации с МЖ выявлялись только погибшие клетки с неактивными и разрушенными митохондриями. Таким образом, после воздействия ЖК количество активных митохондрий снижалось в нормальных фибробластах человека, но не в клетках фибросаркомы. Это свидетельствует о том, что митохондрии опухолевых клеток эпидермоидного происхождения слабо реагировали на ЖК, а митохондрии опухолевых клеток соединительнотканного происхождения были устойчивы к действию агента. После инкубации с МЖ значительная часть митохондрий нормальных кератиноцитов и фибробластов теряла активность, а клетки эпидермоидной карциномы и фибросаркомы находились на поздних стадиях гибели.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА БИОНАНОСТРУКТУР
Результаты этапа: РЕФЕРАТ Растительные гормоны АБК и ГК вызывают индукцию аутофагии в иммортализованных нормальных кератиноцитах НаСаТ, что выражается как на популяционном уровне, так и на уровне отдельных клеток. В то же время, АБК и ГК не оказывают сходного влияния на первичные фибробласты кожи человека. Следовательно, активация аутофагии растительными гормонами, вероятно, проявляется только в клеток эпидермоидного происхождения. Опухолевые клетки линии ТНР-1 (острый моноцитарный лейкоз человека) способны к адгезии и сохраняют потенции к макрофагальной дифференцировке. В связи с тем, что растительные гормоны индуцировали дифференцировку опухолевых кератиноцитов человека, мы проверили, не оказывают ли гормоны сходного слияния на опухолевые клетки мезенхимального происхождения. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЖК, АБК и ГК не оказывают влияния на дифференцировку клеток линии ТНР-1. Это еще раз указывает на то, что действие растительных гормонов на клетки человека может носить ткане-специфический характер. Были продолжены исследования, направленные на изучение роли актиновых филаментов с структурной организации клеток растений. Мы показали, что после инкубации проростков пшеницы в течение 3-24 часов с латрункулином В, наблюдалось разрушение не только сети актиновых филаментов, но и нарушение организации кортикальной сети микротрубочек в интерфазе. В делящихся клетках отсутствовало ППК и веретено деления, что приводило к появлению К-митозов. В то же время, в митотических клетках присутствовали фибриллярные тяжи, выявляемые антителами к тубулину. Следует особо отметить появление не характерных для контрольных клеток, сложной формы лопастных ядер со вздутиями и/или микроядрами. На ультраструктурном уровне выявлялись изменения структурной организации диктиосом аппарата Гольджи, и появление атипичных элементов цитоскелета. Таким образом, длительное воздействие 10 мкМ латрункулина В оказывает влияние на все системы интерфазных и митотических микротрубочек, вызывая переход клеток в К-митоз, а также влияет на структурную организацию диктиосом аппарата Гольджи. Появление сложной формы лопастных ядер и микроядер могут быть результатом завершения К митоза или нарушениями организации ядерной оболочки. РАЗДЕЛ ОТЧЕТА 1 ТЕМА: Сравнительный анализ реакции нормальных и трансформированных культивируемых клеток человека эпителиального и соединительнотканного происхождения на действие растительных гормонов (исполнители – к.б.н. М.С. Вильданова, магистр 2 года обучения Е.П. Турищева). ВВЕДЕНИЕ Растительные гормоны – низкомолекулярные регуляторы роста и дифференцировки растений. Абсцизовая (АБК) и гиббереллиновая (ГК3) кислоты являются условными антагонистами: АБК отвечает за переход растений в состояние покоя в ответ на абиотический и биотический стрессы, а ГК3 является стимулятором роста растений и также может быть вовлечена в реакции на абиотический стресс. Жасмоновая кислота (ЖК) также является гормоном стресса. Известно, что некоторые фитогормоны при определённых концентрациях оказывают разного рода воздействия на клетки животных. Ранее нами было показано, что компоненты синтетической и секреторной системы культивируемых нормальных (кератиноциты HaCaT) и опухолевых клеток (эпидермоидная карцинома А431) кожи человека являются мишенью для действия АБК и ГК3 в субтоксической концентрации 2 мМ. Однако морфологически сходный ответ клеток на действие агентов, выражающийся в гипертрофии ЭПР и комплекса Гольджи, имеет разную функциональную основу. В частности, в опухолевых клетках АБК и ГК3 повышают уровень белка инволюкрина, являющегося маркером дифференцировки кератиноцитов. Изменение состояния везикул кислого компартмента на ультраструктурном уровне, связанное с формированием аутофагосом и аутофагических вакуолей, наблюдается в нормальных кератиноцитах при действии АБК и в опухолевых при действии АБК и ГК3. Усиление аутофагии может быть дополнительным свидетельством в пользу активации процессов дифференцировки. Цель работы: сравнительный анализ реакции нормальных и трансформированных культивируемых клеток человека эпителиального и соединительнотканного происхождения на действие растительных гормонов. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. В работе были использованы клетки линии HaCaT (иммортализованные кератиноциты человека); клетки линии А431 (эпидермоидная карцинома человека); нетрансформированные подкожные фибробласты человека, клетки линии НТ1080 (фибросаркома человека), клетки линии ТНР-1 (моноцитарно-макрофагальная линия человека). 1.1. Задача: изучить влияния фитогормонов на активацию аутофагии в клетках эпидермоидного и соединительнотканного происхождения. Двойное окрашивание клеток НаСаТ, инкубированных с АБК и ГК, флуоресцентным маркёром моноданзилкадаверином и антителами к белку LC3, который является маркером аутофагосом, показало, что в цитоплазме присутствует множество везикул, распределённых в цитоплазме, но с преимущественной локализацией в околоядерной зоне. Определенные везикулы окрашиваются обоими флуоресцентными агентами, в то время как другая субпопуляция – только одним из маркеров. Анализ клеточной популяции показал, что моноданзилкадаверин менее специфичен, чем маркер LC3. В то же время, в определенных клетках с помощью антител к LC3 выявляются крупные и яркие конгломераты везикул. Иногда они также окрашены моноданзилкадаверином. При действии АБК и ГК увеличивается число клеток с крупными LC3-положительными везикулами в среднем в 1,5 раза (число экспериментов = 2-3; n≥500; p≤0,01 по критерию Манна-Уитни). Помимо этого, в клетках, обработанных ГК, были выявлены крупные мембранные сетчатые структуры, окрашенные LC3, происхождение которых пока не установлено. Эти данные были подтверждены с помощью проточной цитофлуориметрии: после обработки ГК, популяция клеток с большей интенсивностью окраски по LC3 возрастала на 11%. В отличие от LC3, окрашивание моноданзилкадаверином не показало разницы в окрашивании после инкубации с гормонами. Следовательно можно сделать вывод, что данный маркёр, широко применяемый для выявления аутофагосом, не является специфичным, по крайней мере в используемой в данной работе клеточной линии. Кроме этого, полученные данные подтверждают полученные ранее данные о том, что при действии растительных гормонов в кератиноцитах активируются процессы аутофагии. В нормальных фибробластах человека, окрашивание антителами к LC3 позволило выявить множество везикул мелкого и среднего размера, а после инкубации с растительными гормонами разницы в размере и количестве LC3-положительных везикул замечено не было. Мы предполагаем, что активация аутофагии растительными гормонами, вероятно, характерна только для клеток эпидермоидного происхождения. 1.2. Задача: установить, влияют ли растительные гормоны на дифференцировку моноцитарно-макрофагальной линии клеток ТНР-1. В отличие от субстрат-зависимых эпителиальных (иммортализованные кератиноциты НаСаТ, эпидермоидная карцинома А431) и соединительнотканных (первичные фибробласты, фибросаркома НТ1080) клеточных линий, клетки ТНР-1 являются суспензионной культурой, которая при действии определенных факторов, имеет потенции к макрофагальной дифференцировке, одним из признаков которых является адгезия к субстрату и распластывание. Кроме этого, моноцитарно-макрофагальная дифференцировка также сопровождается подавлением пролиферации, перестройками цитоскелета и индукцией фагоцитоза. Однако, исследований данных параметров в рамках этой работы не проводилось. Для индукции макрофагальной дифференцировки, в качестве положительного контроля, мы использовали форболовый эфир (24 часа инкубации). В контроле без форболового эфира, через 24 часа после посадки, наблюдалось прикрепление единичных клеток без распластывания. Аналогичная картина наблюдалась после 24 часов инкубации с растительными гормонами АБК, ГК и ЖК - адгезия небольшого числа клеток без распластывания. Следовательно, растительные гормоны не запускают активации дифференцировки по данному параметру (прикрепление и распластывание). 1.3. Задача: исследовать влияния растительных гормонов на состояние компонентов биосинтетической системы и кислого везикулярного компартмента клеток соединительнотканного происхождения. Первичные фибробласты человека представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, в которой можно выделить следующие морфологические типы: веретеновидные клетки, веретеновидные клетки с признаками поляризации, распластанные клетки без признаков поляризации, распластанные клетки с признаками поляризации. Во всех этих типах клеток наблюдаются отличия в морфологии и распределении аппарата Гольджи относительно ядра (компактное однополярное, компактное двухполярное, диффузное однополярное, диффузное) которые, по-видимому, связаны со степенью распластанности клеток, поляризацией и состоянием микротрубочкового цитоскелета. Предварительные данные указывают на то, что при действии АБК в некоторых клетках наблюдался распад аппарата Гольджи, а при действии ГК - его диспергирование. Для того, чтобы установить, как влияют растительные гормоны на структурное состояние аппарата Гольджи фибробластов, в настоящее время проводится детальный структурный и статистический анализ клеток с разным состоянием аппарата Гольджи в зависимости от клеточного морфотипа и состояния микротрубочкового цитоскелета. Опухолевые клетки НТ1080 представлены более однородной популяцией: большинство клеток мелкие и поляризованные, небольшая часть популяции - неполяризованные. В клетках НТ1080 аппарат Гольджи выглядит как компактная лентовидная структура, расположенная в околоядерной области. Предварительные данные указывают на то, что расположение аппарата Гольджи коррелирует с центросомой, определяемой в виде дискретного фокуса схождения микротрубочек. В настоящее время проводится анализ состояния аппарата Гольджи в клетках после действия растительных гормонов, зависимость расположения аппарата Гольджи от центросомного ЦОМТ и способности самого аппарата Гольджи генерировать субпопуляцию микротрубочек. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наши исследования показали, что растительные гормоны АБК и ГК вызывают индукцию аутофагии (по маркеру LC3) в иммортализованных нормальных кератиноцитах НаСаТ, что выражается как на популяционном уровне (проточная цитофлуориметрия), так и на уровне отдельных клеток (более выраженное окрашивание клеточных везикул). В то же время, АБК и ГК не оказывают сходного влияния на первичные фибробласты кожи человека. Наши данные указывают на то, что активация аутофагии растительными гормонами, вероятно, характерна только для клеток эпидермоидного происхождения. Опухолевые клетки линии ТНР-1 (острый моноцитарный лейкоз человека) способны к адгезии и сохраняют потенции к макрофагальной дифференцировке. В связи с тем, что растительные гормоны индуцировали дифференцировку опухолевых кератиноцитов человека, мы проверили, не оказывают ли гормоны сходного слияния на опухолевые клетки мезенхимального происхождения. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЖК, АБК и ГК не оказывают влияния на дифференцировку клеток линии ТНР-1. Это еще раз указывает на то, что действие растительных гормонов на клетки человека может носить ткане-специфический характер. РАЗДЕЛ ОТЧЕТА 2 ТЕМА: Изучение структурных и функциональных изменений клеток корней проростков пшеницы Triticum aestivum L. при действии ингибитора полимеризации актиновых филаментов латрункулина В (исполнитель – к.б.н. Е.М. Лазарева). ВВЕДЕНИЕ Актиновые филаменты в клетках растений участвуют в таких процессах как рост, деление и дифференцировка клеток, регуляция полярности, движении цитоплазмы и органелл, ответ на действие разнообразных стрессовых факторов. Для изучения роли актиновых филаментов используется ингибитор полимеризации латрункулин В, действие которого на клетки обычно ограничивают 60 минутами, однако длительное действие латрункулина В на клетки растений не изучено, хотя эти знания позволили бы более детально изучить роль F-актина в выше перечисленных процессах. В 2016 году нами было показано, что при длительном (3-24 часа) действии низких концентраций 50 нМ латрункулина В происходило разрушение сети актиновых филаментов, при этом наблюдалась незначительная дезорганизация системы микротрубочек в интерфазных и митотических клетках, но серьезных митотических аномалий (К-митозов, отстающих хромосом, хромосомных мостов, появление микроядер, нарушения формирования клеточной пластинки) отмечено не было. Изучение ультраструктуры клеток показало, что воздействие 50 нМ латрункулина В приводило к формированию аномальных элементов цитоскелета – рыхлых фибриллярных тяжей, плотных пучков и фибрилл, закрученных в клубки. Фибриллярные скопления также были обнаружены в ядре интерфазных клеток. Ультраструктура ЭПР, митохондрий и пластид не менялась, однако в составе диктиосом аппарата Гольджи уменьшалось число цистерн, но появлялись многочисленные везикулы вокруг диктиосом. Однако, в большинстве исследований для ингибирования полимеризации актиновых филаментов используется 10мкМ латрункулин В, который добавляют на 30-60 минут. Мы исследовали длительное действие (3-24 часа) высоких доз латрункулина В (10 мкМ) на клетки корней 3-дневных проростков пшеницы Triticum aestivum L. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. В работе проведено изучение систем микротрубочек с использованием антител к тубулину, состояния сети актиновых филаментов с помощью TexasRed-фаллоидина, ультраструктуры клеток с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Установлено, что после 3-24 часов инкубации с 10мкМ латрункулином В, сеть актиновых филаментов в клетках не выявлялась. 1.1. После 3 часов действия латрункулина В, в некоторых интерфазных клетках выявлялись крупные лопастные ядра, а также клетки с микроядрами, которых в контроле выявлено не было (подсчеты не проводились). Также в интерфазных клетках наблюдалась разная степень дезорганизации кортикальных микротрубочек. Делящиеся клетки имели серьезные нарушения систем микротрубочек - профазные клетки не имели ППК, остальные митотические клетки были представлены К-метафазами без митотического веретена или К-телофазами; выявлялись двуядерные клетки с нарушениями цитокинеза. В цитоплазме таких аномальных митотических клетках присутствовали тяжи, выявляемые антителами к тубулину (следует отметить, что в нормальных условиях в митотических клетках цитоплазматические микротрубочки отсутствуют). Анализ ультраструктуры показал, что цитоплазме интерфазных клеток присутствовали атипичные элементы цитоскелета - рыхлые фибриллярные тяжи и клубки филаментов. Пучки фибрилл неизвестной природы также выявлялись в ядре. Диктиосомы аппарата Гольджи были окружены большим количеством мелких везикул, в особенности много везикул располагалось в зоне TGN компартмента. 1.2. После 6 часов действия латрункулина В, в интерфазных клетках выявлялись фрагментированные и неупорядоченные кортикальные пучки микротрубочек, присутствовали сложно формы лопастные ядра и ядра с вздутями. Среди делящихся клеток встречались следующие виды аномалий митоза: отсутствие ППК и веретена, и как следствие, К-метафазные и К-телофазные клетки. Вблизи плазматической мембраны и хромосом присутствовали тяжи, выявляемые антителами к тубулину. Анализ ультраструктуры показал те же структурные особенности, которые были обнаружены после 3 часов действия агента. 1.3. После 12 часов действия латрункулина В в клетках на стадии интерфазы присутствовали редкие кортикальные пучки микротрубочек, многие клетки имели лопастные ядра. Среди митотических клеток наблюдались те же виды аномалий, что и после 6 часов. Анализ ультраструктуры показал те же структурные особенности, которые были обнаружены после 6 часов действия агента, и кроме этого, клубки филаментов были обнаружены внутри вакуолей (возможная микроаутофагия). 1.4. После 24 часов действия латрункулина В в некоторых клетках на стадии интерфазы присутствовали сложной формы лопастные ядра и лопастные ядра со вздутиями. Иммуноцитохимическое окрашивание анителами к тубулину выявило яркие зоны диффузного окрашивания в цитоплазме. Среди делящихся клеток присутствовали клетки на стадии профазы со слабо выраженным ППК, клетки на стадии прометафазы, метафазы и биполярной анафазы с рудиментарным веретеном. Также были обнаружены телофазные клетки с нормально сформированными дочерними ядрами, но аномальной структурой фрагмопласта. Анализ ультраструктуры выявил те же структурные особенности, которые присутствовали на более ранних сроках воздействия (3-12 часов). ЗАКЛЮЧЕНИЕ После однократного добавления 10 мкМ латрункулина В и инкубации в течение 3-24 часов, происходила полная разборка актиновых филаментов. Наряду с этим, наблюдалось нарушение организации кортикальной сети микротрубочек в интерфазе. В делящихся клетках отсутствовало ППК и веретено деления, что приводило к появлению К-митозов. В то же время, в митотических клетках присутствовали фибриллярные тяжи, выявляемые антителами к тубулину. Следует особо отметить появление не характерных для контрольных клеток, сложной формы лопастных ядер со вздутиями и/или микроядрами. На ультраструктурном уровне выявлялись изменения структурной организации диктиосом аппарата Гольджи, и появление атипичных элементов цитоскелета - рыхлых или плотных фибриллярных пучки и клубков филаментов. Однако, через 24 часа не наблюдалось нормальной организации интерфазного и митотического цитоскелета, но выявлялись клетки на стадии метафазы, анафазы и телофазы. Эти данные нуждаются в уточнении, так как нормальное протекание митоза невозможно без правильной организации митотических систем микротрубочек. Таким образом, длительное воздействие 10 мкМ латрункулина В оказывает влияние не только на актиновые филаменты, но и на все системы микротрубочек интерфазных и митотических клеток, вызывая переход клеток в К-митоз, а также влияет на структурную организацию диктиосом аппарата Гольджи. Появление сложной формы лопастных ядер и микроядер могут быть результатом завершения К митоза или нарушениями организации ядерной оболочки. Полученные данные указывают на то, что латрункулин В в концентрации 10 мкМ оказывает влияние на клетки в течении 12 часов, после чего, его активность, по-видимому снижается, и могут начаться процессы восстановления.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".