Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.НИР

Genetics, genomics and genetic engineering of bacteria

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.
Результаты этапа: Продолжено исследование генетического контроля функционирования фотосистем I и II у одноклеточной цианобактерии Synechocystis 6803 c использованием полученных ранее мутантов, лишенных отдельных компонентов фотосинтетического аппарата. Исследована кинетика флуоресценции клеток дикого типа Synechocystis PCC 6803 и мутантов c различным редокс-состоянием пластохинонового пула (PQ). Продемонстрировано высокое содержание фотохимически неактивных реакционных центров ФСII в клетках мутанта Ox. Сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC6803, лишенные одной из дыхательных дегидрогеназ (Cox или Cyd), а также флавопротеинов Flv1/Flv3, участвующих в переносе электронов на кислород на акцепторной стороне фотосистемы I. Выделены бактериологически чистые культуры цианобактерий, обитающих в различных почвенных, водных и растительных биоценозах в ряде климатических зон, включая экстремальные условия Антарктики. Разработаны молекулярно-генетические методы оценки генетического разнообразия доминирующих и минорных цианобактериальных компонентов, как свободноживущих, так и встречающихся в ассоциациях с водными растениями или мохообразными. Расширена имеющаяся на кафедре генетики МГУ коллекция природных цианобактериальных штаммов. Осуществлена морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика ряда ранее неизученных штаммов Anabaena. Проведен молекулярно-генетический анализ этих штаммов. Получены штаммы с повышенной эффективностью выделения молекулярного водорода, перспективные в фотобиотехнологии. Проведен поиск среди низкомолекулярных хелаторов окисного железа сидерофоров, тех, которые способны служить единственным источником окисного железа Впервые показано, что Synechocystis 6803 может использовать в качестве единственного органического источника железа экзогенные дигидроксаматные сидерофоры, такие как шизокинин и сидерофор нитчатой цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413, а также карбоксилатный сидерофор ризоферрин. С помощью направленного инсерционного мутагенеза и функционального анализа исследовано кластер из 14 генов, предположительно кодирующих компоненты систем транспорта сидерофоров. Показано, что все 14 генов исследованного кластера не вовлечены в контроль транспорта неорганического окисного железа в клетки Synechocystis 6803.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.
Результаты этапа: Для выяснения роли апопротеина АрсЕ в механизме ОСР-зависимого нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC 6803 с делецией полной последовательности гена арсЕ, а также последовательностей гена арсЕ, кодирующих петлю в хромофорном домене и один из линкерных доменов. Впервые показано, что у мутанта с полной делецией гена арсЕ отсутствует, а у мутантов с делецией петли и с делецией третьего линкерного домена заметно снижено ОСР-зависимое нефотохимическое тушение флуоресценции фикобилисом. Полученные данные свидетельствуют о том, что сайтом ОСР-зависимого нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом может служить белок АрсЕ. С целью изучения возможности экспрессии генов пурпурных бактерий в клетках цианобактерий сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC 6803, несущие гены антенных белков Puc и Puf, входящих в состав реакционного центра Rhodobacter sphaeroides. Показано, что чужеродные дигидроксаматные сидерофоры шизокинин и сидерофор нитчатой цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413 являются высокодоступными и у Synechocystis 6803 поглощаются при помощи TonB-ExbBD-зависимого транспорта. В рамках исследования генетического разнообразия гетероцистных азотфиксирующих цианобактерий, была существенно расширена коллекция этих микроорганизмов. Изолировано около 50 новых оригинальных штаммов филаментозных гетероцистных цианобактерий, относящихся к порядку Nostocales из различных географических мест обитания. Проведено полногеномное секвенирование двух новых близкородственных симбиотических изолятов модельного штамма филаментозной цианобактерии Trichormus variabilis (Anabaena variabilis ATCC29413). Показано, что ряд изолятов Anabaena (как эпифитных, так и симбиотических) выделенных в различных регионах (США, Вьетнам, Австралия), по некоторым молекулярно-генетическим характеристикам практически неотличимы от модельного штамма Anabaena variabilis ATCC29413. Результаты анализа геномов исследованных штаммов указывают на высокую стабильность генома A.variabilis. На основе штамма Trichormus variabilis (Anabaena variabilis ATCC29413) с использованием разработанной нами оригинальной методики получено и охарактеризовано несколько типов терморезистентных мутантов. С использованием методов генетической инженерии проведено конструирование мутантных штаммов по ряду генов, включенных в процессы образования и выделения молекулярного водорода в клетках Trichormus variabilis.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.
Результаты этапа: 1.Bсследование генетического контроля механизмов гомеостаза железа. Проведено изучение механизмов и генетического контроля систем транспорта органического железа у одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, которая широко используется в качестве модельного объекта в генетических исследованиях. Установлено, что эта цианобактерия, сама не синтезирующая сидерофоры (органические хелаторы трехвалентного железа), способна использовать в качестве единственных источников железа экзогенные дигидроксаматные сидерофоры, продуцируемые другими бактериями. С помощью методов функциональной геномики нами идентифицированы все гены полного пути транспорта сидерофоров из окружающей среды в цитоплазму клетки. Впервые показано, что поглощение дигидроксаматных сидерофоров у Synechocystis осуществляется посредством транспортера SchT наружной мембраны, транспортного белка FecB1 периплазмы, а также ABC-транспортера FecCDE цитоплазматической мембраны. 2. Изучение механизма защиты фотосинтетического аппарата цианобактерий от избыточной световой энергии. При фотосинтезе световая энергия поглощается пигментами антенных комплексов и передается на хлорофилл реакционных центров. Избыток световой энергии поглощается каротиноидами и преобразуется в тепловую энергию (нефотохимическое тушение флуоресценции, или NPQ). У цианобактерий роль антенных комплексов выполняют фикобилисомы, а в NPQ участвует оранжевый каротиноидный белок ОСР. Возможным сайтом взаимодействия ОСР с фикобилисомой у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803является белок ApcE, который имеет несколько функциональных доменов и участвует в стабилизации ядра фикобилисомы, прикреплении PBS к фотосинтетической мембране, передаче световой энергии хлорофиллу фотосистемы II. Для выяснения роли отдельных доменов белка ApcE конструирован мутант Synechocystis sp. PCC 6803, лишенный хромофор-связывающего PBLCM домена ApcE. Мутация приводит к нарушению передачи энергии к терминальным эмиттерам внутри PBS, потере способности PBS прикрепляться к тилакоидной мембране, нарушению процесса передачи энергии от PBS к фотосистеме II и отсутствию OCP-зависимого тушения флуоресценции фикобилисом. Таким образом, PBLCM домена ApcE участвует в формировании сайта связывания ОСР в фикобилисоме. 3. Исследование регуляции путей транспорта электронов в тилакоидной мембране цианобактерий. У эукариотических организмов, осуществляющих оксигенный фотосинтез (растения, водоросли), фотосинтез и дыхание происходят в разных органеллах. У цианобактерий в тилакоидной мембране расположены как фотосинтетическая, так и дыхательная электрон-транспортные цепи, которые имеют общие компоненты, а также имеется ряд альтернативных путей транспорта электронов. Для изучения влияния альтернативных путей транспорта электронов на фотосинтез сконструирован мутант Synechocystis sp. PCC 6803, лишенный флавопротеинов Flv1/Flv3. Анализ светоиндуцированных изменений транспорта электронов на акцепторной стороне фотосистемы I у дикого типа и DFlv1/Flv3 мутанта показал, что на ранних этапах фотоиндукции преобладает циклический транспорт электронов вокруг фотосистемы I, а также перенос электронов на кислород с участием флавопротеинов Flv1/Flv3. Показано, что активация цикла Кальвина в адаптированных к темноте клетках цианобактерий является довольно продолжительным и многофазным процессом. 4.Проведено молекулярно-генетическое изучение близко-родственных штаммов нитчатой азотфиксирующей цианобактерии Trichormus variabilis (ранее Anabaena variabilis), выделенных в различных регионах из водной среды и из ассоциации с растениями риса и папоротника Azolla. Показано, что между изученными штаммы имеются лишь небольшие геномные различия, связанные с единичным перемещением IS-элемента и потерей линейного инцизионного элемента. Проведен биоинформатический анализ совершенных внутригеномных повторяющихся последовательностей. Выявлена высокую степень геномной стабильности у данной группы цианобактерий пор. Nostocales.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.
Результаты этапа: Для изучения механизма нефотохимической диссипации избыточной световой энергии сконструирован мутант цианобактерии Synechocystis PCC6803, у которого часть последовательности гена apcE, кодирующая фикобилин-связывающий домен, заменена последовательностью гена apcA, кодирующего аллофикоцианин. Для изучения роли дыхательной электрон-транспортной цепи в регуляции фотосинтеза у цианобактерий в мутантный штамм Synechocystis PCC6803, лишенный флавопротеинов, акцептирующих электроны от фотосистемы I при включении света, введены мутации по генам, кодирующим субъединицы сукцинатдегидрогеназы, а также цитохром- и хинол-оксидаз. Изучены особенности транспорта электронов через фотосистему I у сконструированных мутантов. С целью исследования генетического контроля и молекулярных механизмов накопления и метаболизма полифосфатов в клетках цианобактерий сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК для получения мутанта Synechocystis PCC6803 с нарушением гена phoU, контролирующего ответ на голодание по фосфору. На предыдущем этапе работы были выявлены и исследованы гены, контролирующие транспорт дигидроксаматных сидерофоров у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Биоинформатический анализ показал, что участок генома, в котором сосредоточены гены компонентов систем транспорта сидерофоров, содержит также три гомологичных гена AraC-подобных факторов транскрипции. По данным литературы гомологи этих генов у ряда бактерий вовлечены в регуляцию транспорта сидерофоров. С целью функционального анализа эти регуляторные гены Synechocystis sp. PCC 6803 были клонированы и в настоящее время проводится работа по их инсерционной инактивации. Выделена новая группа штаммов-изолятов цианобактерий семейства Nostocaceae из отдельных растений мхов, принадлежащих к различным группам мохообразных. Получены аксеничные культуры из которых выделена ДНК для первоначального генотипирования. Выявлено большое таксономическое разнообразие среди полученных изолятов. Показано, что все выделенные штаммы, кроме МР 23-14, являются факультативными гетеротрофами и способны расти в темноте с использованием фруктозы. Штамм МР 23-14 является представителем филы типичных Anabaena sp., которых можно найти среди эпифитных цианобактерий, выделяемых с листьев других растений, например, с листьев растений риса. Штамм МР-24-31 является представителем группы многочисленных изолятов свободноживущего вида Trichormus variabilis, способного к факультативному внеклеточному симбиозу с папоротником Azolla и с печеночными мхам Blasia pusilla. Штамм МР-23-13 представляет группу изолятов факультативных цианобионтов, выделенных с растений мхов Blasia pusilla и Pleurozium schreberi, и родственных модельному факуль- тативно-симбиотическому штамму Nostoc punctiforme ATCC29133. Штаммы МР 24-52 и МР 24-18, хотя и кластеризуются с одним из представителей рода Cronbergia (Cylindrospermum), несколько отличаются друг от друга как по морфологическим признакам, так и по последовательности нуклеотидов в секвенированных фрагментах генов 16S-рРНК.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".