Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.НИР

Cellular and molecular basis of morphogenetic reactions to mechanical stresses

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа: Исследовали градиенты деформаций, формирующихся по ходу развития зародыша амфибий, которые охватывают области порядка сотен микрон и существуют в течение 2-4 часов (макроградиенты). Они по большей части совпадают с главными осями зародыша – анимально-вегетативной, An-Veg (переходящей в передне-заднюю, Ant-Post) и вентро-дорсальной (V-D). Клетки движутся вверх по макроградиентам - в период гаструляции в An-Veg направлении к бластопору, а в период нейруляции – в V-D направлении в сторону замыкания нервной трубки. В результате этих движений градиенты сначала сглаживаются, а потом инвертируются, и тогда движение клеток в прежних направлениях прекращается. По нашим наблюдениям, клетки не останавливаются, а разворачиваются (в зависимости от отсутствия или наличия латеральных препятствий) либо на 90град, либо на 180град, то есть в переднем направлении на стадии поздней гаструлы и в переднем и заднем направлениях на стадиях поздней нейрулы и ранней хвостовой почки. В этих направлениях формируются новые восходящие градиенты. Изменения направлений движения клеток наступают через 20-30 мин после изменения формы макроградиентов. Реальные значения деформаций в малых областях ткани, расположенных по ходу градиента, существенно отличаются от средних значений, то есть макроградиенты модулированы более кратковременными и локальными деформациями. Измерения подтвердили это предположение, причем было обнаружено, что по ходу развития происходит постепенный переход от модуляций, которые условно можно обозначить как жидкофазные или некогерентные к твердофазным или когерентным модуляциям. Этот вывод был основан на измерениях (1) величин соответствующих деформаций; (2) корреляций между траекториями одновременных движений различных клеток; (3) спектрах Фурье по скоростям клеточных движений за последовательные 10-минутные отрезки времени. При изучении пейсмейкерной системы гидроидных полипов, обеспечивающей пульсационный рост на колониальном гидроиде Gonothyraea loveni показано, что блокаторы HCN каналов, такие как затебрадин и ZD7288 ингибируют ростовые пульсации верхушки роста столона. Этот эффект обладает дозозависимостью – по мере увеличения концентрации блокатора эффект усиливается. Интересно то, что низкие концентрации блокатора приводят не к увеличению периода пульсации, а к уменьшению амплитуды пульсации. Это может быть вызвано как уменьшением скорости течения гидроцели, так и нарушениями в системе функционирования верхушки роста. При некоторой концентрации блокатора (30 и 60 мкг/л для затебрадина, 60 и 300 мкг/л для ZD7288) пульсации сохраняются, но становятся нерезультативными. Это может свидетельствовать о том, что нерезультативной становится вторая фаза удлинения столона: в этой фазе удлинение происходит за счет удлинения энтодермального слоя. Переход к фазе сокращения сопровождается излиянием вакуолей эпидермальных клеток во внешнюю среду. Это действие очень быстрое, и во всех эпидермальных клетках оно происходит одновременно. В отличие от обеих фаз растяжения, которые наступают в проксимальных частях верхушки раньше, чем в дистальных, сигнал к этому действию должен проходить очень быстро. Напротив, сигнал к стадии растяжения может быть накопительным. Сигнал, передаваемый посредством HCN каналов, обладает электрической природой. Следовательно, он передается очень быстро и не нуждается в накоплении – и, если полагать схему регуляции прямой, а не опосредованной, то может быть сигналом именно к сбросу вакуолей и переходу в фазу сокращения. Это согласуется с данными об остановке пульсаций в фазу максимального растяжения при блокировании ростовых пульсаций. Идентифицированные нами гены HCN1 и HCN4 в верхушке роста подтверждает возможность передачи сигнала через щелевые контакты. При проведении сравнительного анализа экспрессии механочувствительного рецептора полицистина-1 среди амниот выявлено, что на стадиях гаструляции (стадии 3, 4) у кролика, PKD1 равномерно экспрессируется по бластодиску зародыша. Протоколы гибридизации in situ для зародышей кролика были любезно предоставлены профессором Кристофом Фибаном из университета Гёттингена, выдающимся специалистом в области эмбриологии млекопитающих. Однако интенсивной экспрессии в первичной полоске, как у птиц, мы не обнаружили. Интересным является факт, что в бластодерме присутствуют отдельные клетки с повышенной экспрессиией PKD1. На стадии 3, эти клетки локализуются в основном в области заднего узелка, а на стадии 4 - по краю бластодиска. Какова функция этих клеток покажут последующие исследования. Отличный паттерн экспрессии PKD1 наблюдается в раннем развитии свиньи, где PKD1 экспрессируется только во внезародышевых тканях. Возможно, такое разнообразие паттернов механозависмого рецептора PKD1 будет объяснено после дальнейших функциональных экспериментов. При исследовании роли морфогенетических движений и связанных с ними механических напряжений в формировании пространственной структуры осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки с использованием методов прижизненной количественной регистрации движений индивидуальных клеток была создана экспериментальная модель, в которой содержался весь клеточный материал осевого комплекса, но были подавлены механические натяжения (МН), связанные в норме при гаструляции с клеточными движениями латеро-медиальной конвергенции. Такой моделью стал двойной эксплантат (сэндвич), изготовленный из двух симметричных полосок кольцевой презумптивной мезодермы, разрезанный по дорсо-медиальной и вентро-медиальной линиям. Подавление МН в нем определялось разрезом по дорсо-медиальной оси, что разрушало расположенный именно по этой оси главный аттрактор латеро-медиальной конвергенции. Контролем служили сэндвичи из того же материала, разрезанные в латеральных плоскостях, т.е. сохранившие аттрактор. Каждая серия состояла из 20 образцов, изготовленных на стадиях 10 –10,5 (ранняя гаструла). Тогда как в контрольной серии постоянно возникал полноценный осевой комплекс, в большинстве ( 80%) образцов с разрушенным аттрактором осевые органы отсутствовали. Таким образом, нарушение поля механических напряжений в области дорсального организатора и, как следствие, нарушение паттерна движений клеток этой области, при сохранении всего массива клеток, приводит к подавлению формирования осевых структур. При искусственном растяжении образцов разрушенным аттрактором в дорсо-вентральном направлении, т.е. перпендикулярно естественному направлению растяжения. в эксплантатах в 75% случаев формировались осевые структуры (против 20 % в релаксированных), причем в 40% возникала только хорда, в 10% только сомиты, в 35% хорда и сомиты вместе. Осевые структуры в растянутых сэндвичах со стадии ранней гаструлы располагались в контакте друг с другом и были ориентированы в направлении искусственного растяжения. Это позволяет сделать вывод, что МН, независимо от своего направления, способствуют формированию осевых структур. В связи с обнаруженным подавлением формирования хорды в релаксированных эксплантатах со ст.10, на которой уже хорошо выражена экспрессия специфического маркера хорды гена Chordin, мы исследовали экспрессию гена в нашей модели методом гибридизации in situ. Уже через 4 часа были видны различия в уровне экспрессии в образцах релаксированной и растянутой серий: экспрессия в нерастянутых образцах была ниже, чем в растянутых. Через 24 часа в нерастянутых эксплантатах с разрушенным аттрактором экспрессия гена Chordin была локализована полярно в исходно дорсальной области эксплантата, тогда как в растянутых экспрессия была высокой и хордальная метка была вытянута от дорсального к вентральному концу сэндвича. При продолжении исследования морфомеханических факторов в установлении планарной полярности клеток ресничного эпителия архентерона и их роли для формирования право-левой асимметрии у зародышей Xenopus исходили из того, что зона лево-правого организатора (ЛПО) архентерона гаструлы-нейрулы Xenopus находится в поле механических напряжений (МН), генерируемых хордой и осевой мезодермой, удлиняющихся в передне-заднем направлении. МН через РСР-каскад могут влиять на полярность клеток ЛПО и расположение ресничек. Для проверки этой гипотезы мы перенатягивали с помощью стеклянных игл область ЛПО в направлении перпендикулярном исходному. Растяжения выполнялись как на целых зародышах, начиная со стадии 12, так и на экслантатах дорсальной стороны. Образцы культивировались до ст.19-20. Организацию ресничек в ЛПО исследовали методами сканирующей электронной и лазерной конфокальной микроскопии, а нарушение право-левой асимметрии целых зародышей методом гибридизации in situ с зондом на ген Xnr1. Результаты показали, что растяжение в перпендикулярном направлении никак не влияет на количество и длину ресничек, а только на их расположение, что свидетельствует о механозависимой активации PCP каскада. Результатом переориентирования ресничек являлось нарушение экспрессии Xnr1, который в норме экспрессируется только на правой стороне латеральной мезодермы, а в эксперименте экспрессия исчезала совсем. При исследовании влияния фармакологического блокатора форминов Dia2 SMIFH2, участвующих в поддержании право-левой асимметрии клеток, на распределение ресничек в ПЛО показано, что работа форминов критична для нормального становления лево-правой асимметрии тела на стадии гаструлы-нейрулы, то есть во время работы ресничного организатора в крыше гастроцели. Как показали морфологические измерения, длина ресничек и положение ресничек на клетках принципиально не меняются при воздействии ингибитором форминов SMIFH2. Меняется (а именно уменьшается) сама доля ресничных клеток в области ЛПО. Данные полученные со сканирующей микроскопии, конфокальной микроскопии и гистологии свидетельствуют, что доля ресничных клеток уменьшается оттого, что сама область ЛПО оказывается не полностью раскрытой, и часть клеток, которые на этой стадии в норме должны были бы находиться на внутренней поверхности крыши гастроцели, оказываются перекрыты клетками энтодермы и пространственно лишаются возможности экспонировать реснички в полость гастроцели. Изучение морфологии области ЛПО, развивавшейся и функционировавшей под воздействием модуляторов форминов, показало, что наиболее вероятным эффектом нарушения работы форминов является ослабление левонаправленного тока жидкости в гастроцели за счёт уменьшения числа ресничных клеток, что должно приводить к нарушениям экспрессии гена Xnr1. По нашим наблюдениям, наиболее частым нарушением экспрессии, доля которого быстро возрастает при повышении концентрации ингибитора форминов, является фенотип с полным отсутствием экспрессии Xnr1 – то есть эмбрион как будто имеет две правых стороны.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".