Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.НИР

Cellular and molecular basis of morphogenetic reactions to mechanical stresses

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа: Исследовали градиенты деформаций, формирующихся по ходу развития зародыша амфибий, которые охватывают области порядка сотен микрон и существуют в течение 2-4 часов (макроградиенты). Они по большей части совпадают с главными осями зародыша – анимально-вегетативной, An-Veg (переходящей в передне-заднюю, Ant-Post) и вентро-дорсальной (V-D). Клетки движутся вверх по макроградиентам - в период гаструляции в An-Veg направлении к бластопору, а в период нейруляции – в V-D направлении в сторону замыкания нервной трубки. В результате этих движений градиенты сначала сглаживаются, а потом инвертируются, и тогда движение клеток в прежних направлениях прекращается. По нашим наблюдениям, клетки не останавливаются, а разворачиваются (в зависимости от отсутствия или наличия латеральных препятствий) либо на 90град, либо на 180град, то есть в переднем направлении на стадии поздней гаструлы и в переднем и заднем направлениях на стадиях поздней нейрулы и ранней хвостовой почки. В этих направлениях формируются новые восходящие градиенты. Изменения направлений движения клеток наступают через 20-30 мин после изменения формы макроградиентов. Реальные значения деформаций в малых областях ткани, расположенных по ходу градиента, существенно отличаются от средних значений, то есть макроградиенты модулированы более кратковременными и локальными деформациями. Измерения подтвердили это предположение, причем было обнаружено, что по ходу развития происходит постепенный переход от модуляций, которые условно можно обозначить как жидкофазные или некогерентные к твердофазным или когерентным модуляциям. Этот вывод был основан на измерениях (1) величин соответствующих деформаций; (2) корреляций между траекториями одновременных движений различных клеток; (3) спектрах Фурье по скоростям клеточных движений за последовательные 10-минутные отрезки времени. При изучении пейсмейкерной системы гидроидных полипов, обеспечивающей пульсационный рост на колониальном гидроиде Gonothyraea loveni показано, что блокаторы HCN каналов, такие как затебрадин и ZD7288 ингибируют ростовые пульсации верхушки роста столона. Этот эффект обладает дозозависимостью – по мере увеличения концентрации блокатора эффект усиливается. Интересно то, что низкие концентрации блокатора приводят не к увеличению периода пульсации, а к уменьшению амплитуды пульсации. Это может быть вызвано как уменьшением скорости течения гидроцели, так и нарушениями в системе функционирования верхушки роста. При некоторой концентрации блокатора (30 и 60 мкг/л для затебрадина, 60 и 300 мкг/л для ZD7288) пульсации сохраняются, но становятся нерезультативными. Это может свидетельствовать о том, что нерезультативной становится вторая фаза удлинения столона: в этой фазе удлинение происходит за счет удлинения энтодермального слоя. Переход к фазе сокращения сопровождается излиянием вакуолей эпидермальных клеток во внешнюю среду. Это действие очень быстрое, и во всех эпидермальных клетках оно происходит одновременно. В отличие от обеих фаз растяжения, которые наступают в проксимальных частях верхушки раньше, чем в дистальных, сигнал к этому действию должен проходить очень быстро. Напротив, сигнал к стадии растяжения может быть накопительным. Сигнал, передаваемый посредством HCN каналов, обладает электрической природой. Следовательно, он передается очень быстро и не нуждается в накоплении – и, если полагать схему регуляции прямой, а не опосредованной, то может быть сигналом именно к сбросу вакуолей и переходу в фазу сокращения. Это согласуется с данными об остановке пульсаций в фазу максимального растяжения при блокировании ростовых пульсаций. Идентифицированные нами гены HCN1 и HCN4 в верхушке роста подтверждает возможность передачи сигнала через щелевые контакты. При проведении сравнительного анализа экспрессии механочувствительного рецептора полицистина-1 среди амниот выявлено, что на стадиях гаструляции (стадии 3, 4) у кролика, PKD1 равномерно экспрессируется по бластодиску зародыша. Протоколы гибридизации in situ для зародышей кролика были любезно предоставлены профессором Кристофом Фибаном из университета Гёттингена, выдающимся специалистом в области эмбриологии млекопитающих. Однако интенсивной экспрессии в первичной полоске, как у птиц, мы не обнаружили. Интересным является факт, что в бластодерме присутствуют отдельные клетки с повышенной экспрессиией PKD1. На стадии 3, эти клетки локализуются в основном в области заднего узелка, а на стадии 4 - по краю бластодиска. Какова функция этих клеток покажут последующие исследования. Отличный паттерн экспрессии PKD1 наблюдается в раннем развитии свиньи, где PKD1 экспрессируется только во внезародышевых тканях. Возможно, такое разнообразие паттернов механозависмого рецептора PKD1 будет объяснено после дальнейших функциональных экспериментов. При исследовании роли морфогенетических движений и связанных с ними механических напряжений в формировании пространственной структуры осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки с использованием методов прижизненной количественной регистрации движений индивидуальных клеток была создана экспериментальная модель, в которой содержался весь клеточный материал осевого комплекса, но были подавлены механические натяжения (МН), связанные в норме при гаструляции с клеточными движениями латеро-медиальной конвергенции. Такой моделью стал двойной эксплантат (сэндвич), изготовленный из двух симметричных полосок кольцевой презумптивной мезодермы, разрезанный по дорсо-медиальной и вентро-медиальной линиям. Подавление МН в нем определялось разрезом по дорсо-медиальной оси, что разрушало расположенный именно по этой оси главный аттрактор латеро-медиальной конвергенции. Контролем служили сэндвичи из того же материала, разрезанные в латеральных плоскостях, т.е. сохранившие аттрактор. Каждая серия состояла из 20 образцов, изготовленных на стадиях 10 –10,5 (ранняя гаструла). Тогда как в контрольной серии постоянно возникал полноценный осевой комплекс, в большинстве ( 80%) образцов с разрушенным аттрактором осевые органы отсутствовали. Таким образом, нарушение поля механических напряжений в области дорсального организатора и, как следствие, нарушение паттерна движений клеток этой области, при сохранении всего массива клеток, приводит к подавлению формирования осевых структур. При искусственном растяжении образцов разрушенным аттрактором в дорсо-вентральном направлении, т.е. перпендикулярно естественному направлению растяжения. в эксплантатах в 75% случаев формировались осевые структуры (против 20 % в релаксированных), причем в 40% возникала только хорда, в 10% только сомиты, в 35% хорда и сомиты вместе. Осевые структуры в растянутых сэндвичах со стадии ранней гаструлы располагались в контакте друг с другом и были ориентированы в направлении искусственного растяжения. Это позволяет сделать вывод, что МН, независимо от своего направления, способствуют формированию осевых структур. В связи с обнаруженным подавлением формирования хорды в релаксированных эксплантатах со ст.10, на которой уже хорошо выражена экспрессия специфического маркера хорды гена Chordin, мы исследовали экспрессию гена в нашей модели методом гибридизации in situ. Уже через 4 часа были видны различия в уровне экспрессии в образцах релаксированной и растянутой серий: экспрессия в нерастянутых образцах была ниже, чем в растянутых. Через 24 часа в нерастянутых эксплантатах с разрушенным аттрактором экспрессия гена Chordin была локализована полярно в исходно дорсальной области эксплантата, тогда как в растянутых экспрессия была высокой и хордальная метка была вытянута от дорсального к вентральному концу сэндвича. При продолжении исследования морфомеханических факторов в установлении планарной полярности клеток ресничного эпителия архентерона и их роли для формирования право-левой асимметрии у зародышей Xenopus исходили из того, что зона лево-правого организатора (ЛПО) архентерона гаструлы-нейрулы Xenopus находится в поле механических напряжений (МН), генерируемых хордой и осевой мезодермой, удлиняющихся в передне-заднем направлении. МН через РСР-каскад могут влиять на полярность клеток ЛПО и расположение ресничек. Для проверки этой гипотезы мы перенатягивали с помощью стеклянных игл область ЛПО в направлении перпендикулярном исходному. Растяжения выполнялись как на целых зародышах, начиная со стадии 12, так и на экслантатах дорсальной стороны. Образцы культивировались до ст.19-20. Организацию ресничек в ЛПО исследовали методами сканирующей электронной и лазерной конфокальной микроскопии, а нарушение право-левой асимметрии целых зародышей методом гибридизации in situ с зондом на ген Xnr1. Результаты показали, что растяжение в перпендикулярном направлении никак не влияет на количество и длину ресничек, а только на их расположение, что свидетельствует о механозависимой активации PCP каскада. Результатом переориентирования ресничек являлось нарушение экспрессии Xnr1, который в норме экспрессируется только на правой стороне латеральной мезодермы, а в эксперименте экспрессия исчезала совсем. При исследовании влияния фармакологического блокатора форминов Dia2 SMIFH2, участвующих в поддержании право-левой асимметрии клеток, на распределение ресничек в ПЛО показано, что работа форминов критична для нормального становления лево-правой асимметрии тела на стадии гаструлы-нейрулы, то есть во время работы ресничного организатора в крыше гастроцели. Как показали морфологические измерения, длина ресничек и положение ресничек на клетках принципиально не меняются при воздействии ингибитором форминов SMIFH2. Меняется (а именно уменьшается) сама доля ресничных клеток в области ЛПО. Данные полученные со сканирующей микроскопии, конфокальной микроскопии и гистологии свидетельствуют, что доля ресничных клеток уменьшается оттого, что сама область ЛПО оказывается не полностью раскрытой, и часть клеток, которые на этой стадии в норме должны были бы находиться на внутренней поверхности крыши гастроцели, оказываются перекрыты клетками энтодермы и пространственно лишаются возможности экспонировать реснички в полость гастроцели. Изучение морфологии области ЛПО, развивавшейся и функционировавшей под воздействием модуляторов форминов, показало, что наиболее вероятным эффектом нарушения работы форминов является ослабление левонаправленного тока жидкости в гастроцели за счёт уменьшения числа ресничных клеток, что должно приводить к нарушениям экспрессии гена Xnr1. По нашим наблюдениям, наиболее частым нарушением экспрессии, доля которого быстро возрастает при повышении концентрации ингибитора форминов, является фенотип с полным отсутствием экспрессии Xnr1 – то есть эмбрион как будто имеет две правых стороны.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа: При изучении динамики поверхностных клеток эктодермы зародышей амфибий при нормальном развитии и в модельных системах с измененными паттернами механических натяжений проведены дополнительные цейтраферные микрофотосъёмки дорзальной и спинной сторон зародышей шпорцевой лягушки от стадии поздней бластулы до стадии хвостовой почки и растянутых двойных эксплантатов крыши бластоцеля с ранней гаструлы. В программе Image J прослежены на полученных цейтраферах траектории отдельных клеток и рассчитаны их координаты. В программе Statistica с учетом дополнительных данных проведён статистический анализ. Измеряя напряженные линейные деформации (вызванные различиями в скоростях передвижения клеток) во внешнем клеточном слое эмбрионов Xenopus на стадии зародыша ранней хвостовой почки, мы обнаружили несколько долгосрочных растягивающих градиентов скорости перемещения клеток, модулирующих краткосрочные смещения клеток относительно друг друга, которые в свою очередь значительно увеличивают скорость локальных деформаций. Экспериментальная релаксация напряжений приводила к нарушениям обнаруженных градиентов, однако при этом сохранялись и даже усиливались локальные перемещения клеток. Во время развития, некогерентный режим поведения клеток, характеризующийся обширными смещениями клеток относительно друг друга и плохо коррелирующими траекториями клеток, сменялся на более согласованный режим с противоположными характеристиками. В частности, смена соседей при перемещениях клеток становилась более синхронной и приобретала периодичность в несколько десятков минут. Полученные результаты подтвердили ранее обнаруженное явление наличия микродеформаций в эпиэктодерме и существование характерных градиентов механических напряжений. При исследовании морфогенетических механизмов гаструляции гидроидного полипа Dynamena pumila изучена вариабельность становления главной оси тела по паттернам экспрессии генов - маркеров орального и аборального полюсов. Развитие эмбрионов Dynamena pumila характеризуется эквифинальностью и вариабельностью морфогенезов, а также предполагается, что ведущим фактором упорядочивания клеточных перегруппировок являются механические напряжения. Для описания вариабельности при становлении главной оси тела Dynamena были клонированы участки генов Wnt3 и Frizzled 3 (Fzd3) являющиеся маркерами орального и аборального полюсов у книдарий соответственно. Исследование проводили методом гибридизации in situ. Оказалось, что Wnt3 и Fzd3 имеют крайне вариабельный паттерн развития до стадии препланулы. Более того, ни один из маркеров не коррелировал с появлением морфогенетических очагов эпителизации зародыша и их экспрессия не соответствовала морфологически различимым полюсам эмбриона. Полярная экспрессия обоих генов устанавливалась только к стадии препланулы, причем заживление последнего очага эпителизации всегда наблюдалось на границе экспрессии этих генов. Таким образом, мы показали, что в отличие от всех остальных исследованных книдарий, молекулярная разметка орально-аборальной оси происходит непосредственно перед формированием личинки, а также морфогенетические механизмы гаструляции никак не зависят от механизмов становления полярности тела у Dynamena. Также возникает вопрос, когда и как специфицируются зародышевые листки у Dynamena при наличии таких уникальных механизмов развития. Для этого был выбран ген-маркер эндодермы FoxA. При первоначальном исследовании оказалось, что этот ген экспрессируется как в поверхностных клетках, так и во внутренних клетках эмбриона до стадии поздней гаструлы. Только во внутренних клетках эмбриона FoxA детектировался только перед стадией препланулы. Таким образом, окончательное расположение зародышевых листков происходит только перед началом формирования личинки, что тоже не соответствует данным, имеющимся на сегодняшний день для исследованных книдарий. Были исследованы механизмы тройчатого морфогенеза мутовки побега полипа Dynamena pumila гистологическими и иммуногистохимическими методами. Оказалось, что разделение зачатка происходит не за счет формирования эпителиальных инвагинаций на дистальном слое эктодермы, как считалось раньше, а в результате врастания хитиновых септ. Две пары хитиновых септ начинают расти от внешнего перисарка к центру зачатка. В результате слияния противоположных септ происходит разделение ткани верхушки роста на три части: боковые дифференцируются в гидранты, центральный остается верхушкой роста. Известно, что Wnt канонический путь участвует в спецификации орально-аборальной оси тела у книдарий, однако участвует ли он в морфогенезе сложно устроенных колоний гидроидных полипов до сих пор не известно. Сначала мы исследовали экспрессию генов-компонентов канаонического каскада, оказалось, что действительно в разметке зачатка участвуют как минимум три гена: Brachyury2, TCF и Beta-catenin. Активация канонического Wnt каскада во время формирования первичного полипа блокировала формирование новой верхушки роста и формировались первичные колони без верхушк роста. При длительной активации данного каскада азакенпауллоном пространственная организация колонии сменялась с моноподиально разветвлённой колонии на столониальную колонию. Таким образом мы получили не просто не существующий в природе фенотип, а сменили план строения тела с одного на другой, характерный для других видов гидроидов. Блокирование канонического Wnt iCTR14 приводило к полной блокировке роста и морфогенеза, однако, последующее отмывание блокатора способствовало возобновление роста. В этом случае вместо верхушки роста побега формировалась верхушка роста столона. Данные результаты свидетельствуют о том, что канонический Wnt каскад является не только «головным организатором», как считалось до этого, но и его активность является параметром позиционной информации, участвующей в разметке всего тела. Начата разработка методов количественной регистрации клеточных движений и морфологических характеристик в эмбриональных тканях шпорцевой лягушки с использованием конфокальной микроскопии и автоматического анализа изображений. Для контрастной визуализации клеточных границ были применены механизмы визуализации клеточной мембраны генетическими-кодируемыми маркерам GAP43-GFP и ядер - H2B-mCherry. Визуализированные ядра выступают опорными точками в алгоритме ручной коррекции артефактов распознования, вызванных неравномерностью сигнала. Далее были оптимизированы методики цейтраферной сьемки на инвертированном конфокальном микроскопе Olympus FV-10i. Вместо стандартной 40 мм чашки Петри с субстратом в виде 3% агарозы были использованы 35 мм чашки Петри с дном из покровного стекла, заполненные 1% агарозой с низкой температурой плавления. Зародышей со снятыми желточными оболочками вносили в агарозу и затем ориентировали вблизи покровного стекла с помощью запаянной стеклянной пипетки Пастера. Указанная методика позволила провести прижизненные регионспецифичные цейтраферные съёмки поздних гаструляционных движений. Дальнейшая работа в этом направлении подразумевает повышение выживаемости эмбрионов после экспериментального воздействия, а также съёмки гаструляционных движений на более ранних стадиях развития. Для возможности последующей регистрации механозависимых клеточных движений in vivo с помощью конфокального микроскопа разработан и частично реализован проект автоматизированной установки, позволяющей осуществлять контролируемое двухосевое растяжение подложки с прикреплёнными эксплантатами ткани. Режим деформации подложки будет подобран с учётом анализа упомянутых выше цейтраферных съёмок гаструляционных движений в интактных зародышах для достижения наибольшего сходства экспериментального воздействия с условиями нормального развития. Была исследована роль механических напряжений в ходе формирования осевого комплекса амфибий. Для этого использовали модель двойного эксплантата из латеральных губы средней гаструлы шпорцевой лягушки. Для визуализации ткани сомитов и хорды была использована методика гибридизации in situ. Для этого были клонированы участки генов MyoD в качестве маркера сомитов и гена Chordin в качестве маркера клеток хорды. Оказалось, что все составляющие осевого комплекса располагались на выгнутой стороне деформированных эксплантатов. Также деформация стимулировала формирование сомитов. В деформированных эксплантатах наблюдалось достоверное увеличение количества сомитов на 10% по сравнению с недеформированными. Различий в размерах сомитов отмечено не было. Расположение хорды и сомитов в недеформированных эксплантатах было рандомизированным. Таким образом, деформация эмбриональной ткани приводит к стимуляции морфогенетических процессов и необходима для правильной пространственной разметки осевого комплекса. Были продолжены исследования влияния блокатора форминов семейства Dia SMIFH2 на установление право-левой оси организма у амфибий по выявлению методом гибридизации in situ экспрессии генов Xnr1 и Pitx2, в норме экспрессирующихся в боковой мезодерме с левой стороны тела. Было проведено не менее 5 повторностей эксперимента с выборкой не менее 70 зародышей в каждой точке. Мы выяснили, что критическим этапом функционирования форминов в развитии является стадия средней-поздней гаструлы, во время формирования лево-правого организатора, а не стадии дробления как считалось до этого. Блокирование форминов во время гаструляции приводило к рандомизации становления лево-правой асимметрии и нарушению экспресии генов Xnr1 и Pitx2.Так как многие нарушения при становлении лево-правой оси у позвоночных связаны именно с нарушенем гена FoxJ1, отвечающего за формирование ресничек в лево-правом организаторе, мы исследовали его экспрессию после блокирования форминов. Мы не обнаружили достоверного нарушения его экспрессии. Таким образом, можно предположить, что критическое значение формины имеют для регуляции динамики актинового цитоскелета во время морфогенеза крыши гастроцеля и области лево-правого организатора
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Клеточные и молекулярные основы морфогенетических реакций на механические напряжения.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".