Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.НИР

Research of the mechanisms of differentiation and integration of differentiated systems in the animal development as a basis of improvement of medical technologies.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа:
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: При отработке модификаций метода криоконсервации зрелых ооцитов млекопитающих ооциты мыши линии С57BL, полученные путем извлечения из яйцеводов после спаривания с вазэктомированным самцом, криоконсервировали с использованием бездиметилсульфоксидной криопротекторной среды. Состав среды: этиленгликоль 36%, фиколл 25%, сахароза 0,4М, растворенные в среде KSOM. Для проведения криоконсервации ооциты мыши очищали от клеток сorona radiata ферментным способом, выдерживали в предварительном растворе (криопротекторный раствор, разбавленный средой KSOM в 2 раза) в течение 2 мин., затем выдерживали в криопротекторном растворе в течение 2 мин. и помещали на носитель для замораживания. Размораживание проводили в растворе сахарозы (1М на среде KSOM) Выживаемость ооцитов оценивали по морфологическим признакам и способности к оплодотворению. 92% ооцита сохраняли морфологические признаки живого ооцита. Оплодотворение методом ИКСИ приводило к формированию пронуклеусов в 55% случаев от числа выживших ооцитов, что достоверно не отличается от контрольного оплодотворения интактных ооцитов методом ИКСИ. Однако развитие эмбрионов происходило с задержками и не приводило к формированию бластоцист. Продолжены работы по анализу функционального состояния ооцитов мыши, полученных из первичных фолликулов, выращенных in vitro в условиях 3D системы с использованием гидрогелевых альгинат-содержащих матриксов. Собран материал для проведения анализа активности генома клеток культивируемых фолликулов методом ПЦР в режиме реального времени. Были проведены исследования по сокультивированию первичных многослойных фолликулов с клетками стромы яичника в 3D культуре. Первичные культуры клеток стромы яичника человека получали из фрагментов криоконсервированной овариальной ткани и культивировали в монослое до 3-4 пассажа в стандартных (DMEM/F12; 20нг/мл bFGF, ИТС и 10% ФТС). Первичные многослойные фолликулы из яичников половозрелых самок мышей линии BDF1 и культивировали индивидуально в 3D условиях в системе «висячая капля» в течение 7 сут. В опытной группе к каждому фолликулу добавляли по 3000 ксеногенных клеток стромы яичника человека, к контрольным фолликулам клетки не добавляли. В опытной группе клетки и фолликулы формировали общую структуру, в которой ксеногенные клетки занимали поверхностное положение. Анализ экспрессии маркеров функционального состояния фолликулов проводили с помощью ПЦР в реальном времени с использованием видоспецифичных праймеров. Через 7 сут. в опытной группе, в сравнении с контрольной, возрастал уровень мРНК генов стероидогенеза CYP19A1 и андрогенов CYP17A1, рецепторов фолликулостимулирующего (FSHR) и лютеинизирующего (LHR) гормонов. Значимые различия выявлены только в экспрессии генов мыши, но не человека. То есть, сокультивирование овариальных фолликулов мыши с клетками первичной культуры стромы яичника человека приводило к активации процессов стероидогенеза в самом фолликуле, но не в добавленных клетках. Вероятно, добавление стромальных клеток к овариальным фолликулам стимулировало в них экспрессию функционально значимых для нормального роста и развития генов. При исследовании роли пространственных параметров при культивировании in vitro на поведение клеток млекопитающих получены первичные культуры клеток постмортального пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) глаза человека. Клетки ПЭС, выращиваемые в условиях монослойного 2D культивирования успешно формировали монослой и сохраняли высокий пролиферативный потенциал до 4 пассажа. На первых двух пассажах клетки в культуре имели эпителиальный фенотип, к 4 пассажу в культуре возрастало количество фибробластоподобных клеток. На 4 пассаже ПЭС экспрессировали ключевой пигмент ретиноидного цикла, участвующий в регенерации светочувствительного пигмента PRE65, а также свойственные мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам поверхностные маркеры CD105, CD90, и не экспрессировали маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда. Переведение культуры ПЭС 4 пассажа в условия неадгезивного 3D культивирования приводило к формированию клеточных сфероидов. Сфероиды из клеток ПЭС формировались за 7сут за счет агрегации клеток в первые сутки и последующей компактизации. В составе сформированных сфероидов обнаружили две области: поверхностную и центральную. Клетки поверхностной области имели уплощенную форму, плотно прилегали друг к другу, клетки центральной области были округлыми, между ними постепенно накапливался внеклеточный матрикс. Были проведены эксперименты по изучению поведения клеток млекопитающих при культивировании на волокнах, изготовленных методом электроспиннинга из синтетических полимеров – поликапролактона и нейлона. В ходе предварительных экспериментов, проведенных на мезенхимных клетках, выделенных из костного мозга, было показано, что клетки обладают адгезией к субстрату из синтетических волокон, но необходимо модифицировать поверхность, чтобы сделать её более привлекательной для клеток. После покрытия поверхности пленок поли-L-орнитином наблюдали лучшее распластывание клеток. Было установлено, что при культивировании иммортализованных кератиноцитов человека (HaCaT) на ориентированных и неориентированных субстратах различается поляризация ядер клеток. У клеток, выращенных на ориентированных субстратах, поляризация ядер была выше, чем у клеток, выращенных на субстратах из волокон, уложенных хаотично. Также было показано, что актиновые микрофиламенты также ориентированы по направлению вдоль волокон субстрата. При исследовании репаративной регенерации позвоночных разработана новая простая воспроизводимая модель с целью изучения механизмов репарации и регенерации in vitro с применением современных методов лазерной микрохирургии клеточных сфероидов. Для этого с помощью наносекундного лазерного скальпеля провели микродиссекцию поверхностной и внутренней зон сфероидов из дермальных фибробластов. Для эффективной диссекции с сохранением жизнеспособности сфероида были подобраны оптимальные параметры «лазерного скальпеля». Уже в течение первого часа после воздействия на сфероиды лазерным излучением форма выживших после повреждения клеток изменялась - клетки на поверхности сфероида и непосредственно в области повреждения становились округлыми. Через сутки после микродиссекции структура сфероидов начинала частично восстанавливаться, клетки в поверхностных слоях начинали принимать исходную уплощенную форму, дебрис из погибших поврежденных клеток и их фрагментов постепенно исключался из состава сфероида. На предложенной модели получены первые данные по стимуляции восстановления структуры поврежденных сфероидов из дермальных фибробластов синтетическим пептидом Р199, который применяют в косметологии для инициации антивозрастных и регенерационных эффектов в коже. После микродиссекции восстановление структуры сфероидов из фибробластов с несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны в присутствии пептида Р199 происходило быстрее, чем в контрольной группе, и завершалось в течение 7сут, предположительно за счет ремоделирования выживших клеток. При исследовании возрастных особенностей динамики репарационного восстановления пигментной системы личинок амфибий и участия мелатонина в этом процессе было проведено количественное определение мелатонина в теле личинок шпорцевой лягушки и в основных мелатонинсекретирующих органах (эпифизарный комплекс, латеральные глаза и желудочно-кишечный тракт) методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ультраэффективной жидкостной хроматографией в процессе регенерации пигментной системы после ее локального разрушения. Показано, что динамика изменения содержания гормона коррелирована во всех мелатонинсодержащих органах и в теле личинки. Выявлен подъем уровня гормона в начальный период после операции по разрушению меланофоров, причем интенсивность восстановления пигментной системы соответствовала более высокому содержанию мелатонина в теле личинок на белом фоне на 2 день после операции, что согласуется с полученными ранее данными по чувствительности процесса регенерации к добавлению экзогенного гормона именно в эти сроки. Таким образом, 2-й день после операции является гормон-зависимым периодом, во время которого мелатонин проявляет эффект, стимулирующий репарационный процесс. Методом привитой сополимеризации исследовали in vitro возможность участия СР-реакций в процессах метилирования ДНК (совместно со ст.н.с. Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН А.А. Ивановым). Получили предварительный положительный результат: изменения уровня радиоактивного индикатора радикальной сополимеризации при добавлении метилазы к препарату ДНК указывает на появление свободнорадикальных состояний. Показано, что инкубация зародышей вьюна Misgurnus fossilis с момента оплодотворения во вращающемся магнитном поле (магнитная индукция 200 Гс ) влияет на жизнеспособность и темп эмбрионального развития зародышей. При 6, 10 и 20 Гц ВМП наблюдается достоверное (р ≤ 0,01) снижение смертности в группах и ускорение развития зародышей. Дальнейшее увеличение частоты вращения замедляет развитие и повышает гибель зародышей в группах до 100%. Степень проявления влияния ВМП зависит от исходного качества икры. Было изучено действие электромагнитного излучения КВЧ-диапазона (7,1 мм) на клеточные культуры с разными морфогенетическими потенциями: культуры клеток HeLa, HaCaT и МСК. Проведено сравнение действия непрерывного излучения (4 мВт/см2) и импульсного (8 Гц, 2 мВт/см2) на указанные культуры. В качестве критериев оценки действия излучения учитывали изменение числа клеток. Показаны специфические различия в реакции клеточных линий на излучения одного типа. После непрерывного излучения обнаружено достоверное увеличение числа клеток МСК (на 20% по сравнению с контрольной группой), замедление роста культуры HeLa (на 16%), в культуре HeLa достоверной реакции не обнаружено. Импульсное излучение приводило к ускорению роста числа клеток HaCaT (на 54%), снижению роста числа HeLa (на 40%), в культуре МСК достоверного изменения числа клеток обнаружено не было. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение о большей чувствительности более дифференцированных делящихся клеток к излучению КВЧ. Показано, что изменения изотопного состава углерода находят отклик в морфологических и функциональных проявлениях организмов. Так, обогащение тяжелым стабильным изотопом углерода (при культивировании в фотобиореакторе в среде, насыщенной 13СО2) приводит к увеличению объема автоспор и ускоряет в 1,1 раза темпы умножения Chlorella vulgaris в сравнении с таковом при культивировании с природным СО2 (98,9% 12С, 1,1% 13С). Культивирование в 12СО2, напротив, существенно сокращает объем автоспор и замедляет темпы умножения клеток (в 0,64 раза в сравнении с контролем). Выявлено, что содержание нескольких последовательных поколений Daphnia magna на хлорелле, обогащенной 13С и 12С, приводит к существенному сокращению репродуктивности (числа овуляций, численности овулировавших яиц и числа успешно развивающихся зародышей) и продолжительности существования когорт второго и третьего поколений. В третьем и четвертом поколениях эти показатели восстанавливаются до уровня, сопоставимого с контрольными когортами (т.е. культивировавшихся на хлорелле, выращенной на природном углекислом газе). Фазическое снижение плодовитости существенно более выражено в когортах, содержавшихся на изотопно-легкой хлорелле. Предположено, что описанные выше проявления живых существ связаны с модификациями метаболизма, привносимыми магнитным изотопным эффектом тяжелого изотопа углерода.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа: Сохранность биологического материала при криоконсервации –ключевая проблема криобиологии, и, как конкретное практическое приложение, интенсификации методов ЭКО. Проведена модификация метода Куваямы для криоконсервации ооцитов мыши. Модификация коснулась последовательности насыщения диметилсульфоксидом ооцитов мыши и полной заменой в криопротекторном растворе сывороточного альбумина на фиколл. В отличие от метода Куваямы насыщение клеток криопротекторами (этиленгликоль и ДМСО) проводили не одновременно, а последовательно: сначала выдерживали ооциты в 7,5% этиленгликоле на среде (5 мин), а затем присоединяли к раствору ДМСО 7,5% (еще 5 мин). При этом удалось полностью исключить гибель ооцитов в результате токсического воздействия диметилсульфоксида. В рамках исследования ранних этапов оогенеза и фолликулогенеза методом количественного ПЦР анализа (ПЦР в реальном времени) была изучена экспрессия генов основных участников сигнального каскада Hippo (MST1, LATS ½ и Yap) в эмбриональных яичниках мышей (Е14,5-17,5). Было показано, что наибольший уровень экспрессии наблюдается на 16,5 сутки внутриутробного развития. Повышение уровня экспрессии исследуемых генов наблюдается непосредственно перед началом фрагментации гетерогенных овариальных цист и массовой гибели женских половых клеток. Иммуноцитохимическое окрашивание криостатных срезов эмбриональных яичников мыши выявило колокализацию флуоресцентного сигнала, соответствующего белкам LATS ½ и YAP, и каспаз 3/7 в зонах скопления соматических клеток. Наибольшая интенсивность флуоресцентных сигналов была обнаружена на срезах яичников 16,5 и 17,5 суток эмбрионального развития. В ходе настоящего исследования с применением метода количественной ПЦР в режиме реального времени был проведён анализ уровней экспрессии ряда генов, отвечающих за инициацию мейотического созревания в ооцитах, полученных в результате культивирования in vitro овариальных фолликулов мыши. Так, было показано, что уровень экспрессии таких генов как Epab (отвечающего за синтез одноименного белка, обеспечивающего регуляцию уровня трансляции в ооцитах), а также гена Ccnh (кодирующего субъединицу САК-комплекса, который отвечает за активацию MPF-комплекса) существенно ниже (показаны статистически значимые различия) по сравнению с ооцитами, полученными из мышей in vivo. В то же время проведённое исследование по генам Mos (начальный член МАРК-каскада), Wee2 (регулятор MPF-комплекса), Cdk1 и Ccnb (гены, кодирующие белки, являющиеся компонентами MPF-комплекса) показало отсутствие статистически значимых различий в уровнях экспрессии в ооцитах, полученных в результате культивирования овариальных фолликулов in vitro и ооцитов, выделенных из мышей in vivo. Одной из ключевых проблем клеточной заместительной терапии дисфункций опорно-двигательного аппарата и миодистрофий остается доступность аутологичных источников клеточного материала, способного дифференцироваться в миогенном направлении. Уникальное онтогенетическое происхождение и способность к бесфиброзной репарации большинства ран ротовой полости делает клетки десны одним из перспективных источников аутологичного клеточного материала. Было проведено изучение стромальных клеток альвеолярной слизистой оболочки десны человека в 3D условиях культивирования. В условиях 3D культуры из стромальных клеток десны за 7сут за счет агрегации клеток в первые сутки и последующей компактизации формировались компактные сфероиды. В составе сформированных сфероидов обнаружили две области: поверхностную и центральную. Клетки поверхностной области имели уплощенную форму, плотно прилегали друг к другу, клетки центральной области были округлыми, между ними постепенно накапливался внеклеточный матрикс. В сфероидах из стромальных клеток альвеолярной слизистой оболочки десны показали индуцированную и спонтанную дифференцировку клеток в миогенном направлении с образованием миофибрилл с характерным расположением ядер по периферии и поперечной исчерченностью, выявляемой окрашиванием антителами к белку саркомерному α-актинину. С применением современных методов лазерной микрохирургии клеточных сфероидов разработана новая простая воспроизводимая модель с целью изучения механизмов репарации и регенерации in vitro. Для этого с помощью наносекундного лазерного скальпеля провели микродиссекцию поверхностной и внутренней зон сфероидов из эпителиальных клеток, мезенхимных клеток и дермальных фибробластов. Уже в течение первого часа после воздействия на сфероиды лазерным излучением форма выживших после повреждения клеток изменялась - клетки на поверхности сфероида и непосредственно в области повреждения становились округлыми. Через сутки после микродиссекции структура сфероидов начинала частично восстанавливаться, клетки в поверхностных слоях начинали принимать исходную уплощенную форму, дебрис из погибших поврежденных клеток и их фрагментов постепенно исключался из состава сфероида. Восстановление структуры сфероидов с несколькими поверхностными слоями уплощенных черепицеобразно расположенных клеток и полигональными клетками внутренней зоны происходило для всех проанализированных культур без пролиферации за счет ремоделирования выживших клеток. При разработке новой модели, позволяющей проследить сочетание клеточных и организменных уровней в процессе регенерации, проведено сравнение компетенций различных зон поверхности тела личинки шпорцевой лягушки Xеnopus laevis к восстановлению пигментных клеток (меланофоров) после их локальной утраты в результате механического повреждения стеклянным зондом. На седьмой день после повреждения в области между головным мозгом фронтальным глазом восстановления пигментации не наблюдается. В области между головным мозгом и ноздрями появление единичных новых меланофоров наблюдали только у 1/3 оперированных животных. На участках каудальнее и вентральнее глаз регенерация пигментной системы идет интенсивно - число клеток на седьмой день превышает число разрушенных, новые меланофоры мельче и расположены плотнее, чем меланофоры до операции. Прослежено, что на участках интенсивного восстановления пигментной системы повреждение единичных меланофоров компенсируется за счет изменения формы и размеров прилежащих к месту повреждения пигментных клеток, новые клетки не появляются в стандартных временных границах эксперимента. Прослежено влияние КВЧ-излучения на регенерацию пигментной системы покровов личинок шпорцевой лягушки Xеnopus laevis. Установлено, что 30-ти минутное облучение личинок после локального разрушения меланофоров (длина волны 7.1 мм, непрерывная модуляция, мощность 4 мВ/см2) приводило к резкому угнетению последующего восстановлении пигментации. После облучения через 9 дней на месте поражения облученных личинок восстанавливается не более 30 процентов от прежнего числа клеток, тогда как у личинок контрольной группы восстанавливается 90-110% пигментных клеток) Установлено, что степень влияния вращающегося магнитного поля (магнитная индукция 200 Гс ) на ранних зародышей вьюна Misgurnus fossilis зависит от исходного качества икры. 20-ти часовая инкубация в условиях ВМП с момента оплодотворения зародышей, развивающихся из икры высокого качества (выживаемость в контроле 90,1±2,64 %), не влияет на выживаемость зародышей при частотах 6, 10 и 20 Гц или снижает выживаемость его до 41,2±2,14 % при 30 Гц, до 28,3±1,44 % при 35 Гц и приводит к 100% гибели эмбрионов при ВМП 50, 75 и 100 Гц. При снижении качества икры (выживаемость в контроле 35,2±1,65%) ВМП достоверно (р ≤ 0,01) снижают выживаемость зародышей до 6,1 ± 0,32% при 30 Гц и до 100% гибели при действии 35, 50 или 100 Гц, но достоверно (р ≤ 0,01) повышает выживаемость до 54 – 63 % при 20, 10 и 6 Гц. Инкубация в условиях ВМП оказывает влияние и на темп эмбрионального развития, причем степень проявления эффекта не зависит от исходного качества икры. Под действием ВМП с частотой вращения 6 и 10 Гц наблюдается четкое увеличение темпа развития, при 20 Гц ВМП стимуляция ускорения развития резко уменьшается, а при 30 Гц ВМП, наоборот, на фоне повышения смертности зародышей в группе наблюдается легкое торможение темпа эмбрионального развития по сравнению с соответствующими контрольными группами. Прослежена динамика люцигенин-зависимого сверх-слабого излучения (ЛЗ-ССИ) планарий, регистрируемого с помощью оcнащенного фотоумножителем люминометра Биотокс-7а, на ранних сроках регенерации после (1) одной поперечной перерезки на уровне антериорной четверти или после (2) троекратных перерезок (на уровне антериорной четверти, перед глоткой и на уровне постериорной четвери по антерио-постериорной оси планарии). Всплеск ЛЗ-ССИ наблюдали сразу после перерезки, затем в течение примерно 2–4 часов уровень ЛЗ-ССИ снижался до уровня излучения интактного животного, а через 10–12 часов после перерезки наблюдали второй всплеск ЛЗ-ССИ, по времени соответствующий пику митотической активности необластов (стволовых клеток планарии), обеспечивающих репарацию раны. Уровень второго пика, регистрируемого от животных после троекратной перерезки, более, чем в 2 раза превышал таковой при однократной перерезке. Т.о. показана прямая корреляция пика ЛЗ-ССИ со степенью травмирования животных, что прямо связано с числом пролиферирующих необластов. Продолжается исследование in vitro методом привитой сополимеризации возможности участия СР-реакций в процессах метилирования ДНК (совместно со ст.н.с. Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН А.А. Ивановым). Получили предварительный положительный результат: при добавлении к препарату ДНК метилазы изменение уровня радиоактивного индикатора радикальной сополимеризации указывает на наличие свободнорадикальных состояний.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Исследование механизмов дифференцировки и интеграции дифференцирующихся систем в развитии животных как основа совершенствования медицинских технологий.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".