Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клетокНИР

Hormone binding proteins, hormonal response and cell differentiation.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клеток
Результаты этапа: Показано, что пролактин стимулирует экскрецию и клиренс ионов натрия и бикарбонатов и ингибирует их реабсорбцию в модели холестаза беременных. Проведено иммуногистохимическое изучение манифестации электрогенного (Na+/HCO3-) котранспортера NBCe-1 в проксимальных канальцах почки крысы в модели холестаза беременных. Показано, что уровень экспрессии NBCe1 в проксимальных канальцах в модели холестаза беременных не отличается от контрольных групп, но в группах с обструктивным холестазом и в модели холестаза беременных наблюдается снижение экспрессии белка на базолатеральной мембране и увеличение интенсивности его экспрессии в других компартментах клетки. Установлено, что клиренс бикарбонатов не коррелирует с экспрессией NBCe-1 у экспериментальных групп животных. Исследованы половые различия во влиянии гиперпролактинемии на водно-солевой обмен. Установлено, что у самцов в отличие от самок, пролактин не оказывает достоверного влияния на потребление воды, суточный диурез, суточную экскрецию, клиренс натрия и его реабсорбцию. Кроме того, у самцов в отличие от самок не наблюдается достоверных изменений в суточной экскреции бикарбонатов. Однако, у самцов, как и у самок, концентрация бикарбонатов в сыворотке достоверно понижается при гиперпролактинемии. У самцов клиренс бикарбонатов достоверно увеличивается только при холестазе, тогда как у самок повышение наблюдалась во всех экспериментальных группах. Изученo участие Na+ /K+-АТPазы в реализации натрийуретического действия пролактина в модели холестаза беременных. Показано, что активность Na+/K+-АТPазы в мозговом слое почки снижается в модели холестаза беременных и других вариантах гиперпролактинемии относительно нормы. Отработан метод иммуноблоттинга для определения белкового продукта альфа- и бета-субъединиц Na/K-АТФазы. Показано, что уровень белкового продукта 1- и -субъединиц Na+/K+-АТPазы, измеренный методом иммуноблоттинга, не меняется в модели холестаза беременных. Установлено, что в коре почки снижение активности Na+/K+-АТPазы не достигало достоверных различий, так же, как и уровень мРНК и белкового продукта 1- и -субъединиц Na+/K+-АТPазы. Корреляций между активностью Na+/K+-АТPазы и клиренсом натрия не обнаружено, хотя клиренс натрия достоверно возрастал в модели холестаза беременных в других группах с гиперпролактинемией при стабильной скорости клубочковой фильтрации, измеренной по клиренсу креатинина. Отработан метод иммуноблоттинга для определения уровня манифестации транскрипционного фактора STAT5 в фософрилированной и нефосфорилированной форме для оценки возможности прямого влияния пролактина на почку и посредников его действия. Проведена проверка разработанной ранее системы тестирования агонистической и антагонистической активности прогестинов в отношении мембранных рецепторов прогестерона человека (с использованием репортерной плазмиды, содержащей ген бета-галактозидазы под промотором FET- гена, чувствительного к сигнальному пути мембранных PAQR рецепторов) на контрольных колониях дрожжей, не экспрессирующих рецептор, но содержащих репортерную плазмиду. В результате выявлены артефакты, которые могли фальсифицировать результаты экспериментов. Проведена работа по устранению этих артефактов. Начато тестирование агонистической активности перспективных аналогов прогестерона, проявляющих свойства селективных лигандов mPR. Проведено изучение эффектов 3х концентраций прогестерона и 3х концентраций одного из 2х наиболее селективных лигандов mPR на продукцию интерлейкинов IL-1β и IL-10 в мононуклеарных клетках периферической крови 4 доноров методом ELISA, однако из-за значительных индивидуальных различий для выводов необходимо набирать большую статистику. Сделана попытка активировать клетки культуры Jurkat (T-cell leukemia) человека с помощью антител - mouse antihuman CD3/CD28 двумя разными способами (поочередно и совместно), а также другими стимуляторами. Однако на настоящий момент мы не обнаружили активной продукции этими клетками изучаемых интерлейкинов. Также получены новые линии лимфобластов - К562 (хроническая миелогенная лейкемия) и моноцитов ТНР1 (моноцитарная лейкемия) для изучения воздействия прогестерона и селективных лигандов mPR на иммунные реакции организма. Изучается активация этих клеток антителами mouse antihuman CD3/CD28, липополисахаридами. Подобраны, заказаны и проверены праймеры для определения мРНК IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, INFgamma, TGFbeta, TNFalpha, TLR4. Начато определение экспрессии генов перечисленных факторов иммунного ответа в мононуклеарных клетках периферической крови под действием прогестерона и 2х селективных лигандов мембранных рецепторов.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клеток
Результаты этапа: Тема 1. Влияние половых гормонов на метаболические системы бисексуальных висцеральных органов, прямо не связанных с размножением. При исследовании влияния гиперпролактинемии на течение холестаза беременных показано, что в коре и мозговом слое почки экспрессируются короткая и длинная изоформы рецептора пролактина, коррелирующие друг с другом при разном уровне пролактина. В мозговом слое почки их экспрессия существенно растет в условиях холестаза, но этого не происходит, если холестаз осложнен гиперпролактинемией. Показано, что в модели холестаза беременных во внешнем мозговом слое почки статистически значимо увеличивается экспрессия фосфоSTAT5 по сравнению с нормой, что свидетельствует об активности длинной формы рецептора при проведении сигнала. Проведен первый этап работы по определению в коре и мозговом слое почки исследуемых экспериментальных групп животных влияния пролактина на экспрессию мРНК белков SOCS, CIS, GALT, FOXO3, участвующих в проведении сигнала пролактина. Тема 2: Пролактиновая ось трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus в регуляции адаптации и размножения. В мозге трёхиглой колюшки Gasterosteus aculeatus методом количественной ПЦР в реальном времени обнаружена экспрессия пролактина, пролактинподобного гормона и обоих типов рецептора пролактина. Установлено, что уровень пролактинового рецептора b в мозге самцов и самок колюшки достоверно превышает экспрессию этого рецептора в жабрах и почке животных обоего пола при их содержании в морской воде. Не выявлено статистически значимых различий между самцами, находившимися в морской и в пресной воде, по экспрессии гена Prl1, PrlRa и PrlRb в мозге. В морской воде выявлена зависимая от пола экспрессия PrlRa в мозге (выше у самцов). Продемонстрировано, что при адаптации к условиям пресной воды возникают половые различия в экспрессии гена пролактина Prl1 в мозге с преобладанием у самок. Тема 3. Гормональные аналоги избирательного действия Создана модельная дрожжевая система для тестирования активности лигандов мембранного рецептора альфа прогестерона. Исследованы эффекты эффекты 19-гидроксипрегн-4-ен-20-она (I) и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-она (II) в сравнении с прогестероном на пролиферацию клеток линии ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы в XTT тесте (Cell Proliferation Assay). В ранее созданной модельной дрожжевой системе прогестерона изучена агонистическая и антагонистическая активности 19-гидроксипрегн-4-ен-20-она (I) и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-она (II), являющихся селективными лигандами mPR, в отношении ядерного рецептора В прогестерона. Тема 4: Роль серпинов в канцерогенезе Обнаружено изменение уровня альфа1-антитриспина в опухолях различного происхождения. Скрининг активности гена SERPINA1 на участке экзона 5 в указанных клеточных линиям показал, что ген проявляет наибольшую активность в линии DU145 (среди линий непеченочного происхождения). Анализ секретомов этих же клеточных линий подтвердил, что DU145 секретирует максимальное количество белка. Анализ ядерного и цитоплазматического экстракта линии клеток DU145 показал наличие белка в обоих экстрактах.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клеток
Результаты этапа: Тема 1. Влияние половых гормонов на метаболические системы бисексуальных висцеральных органов, прямо не связанных с размножением. Оценена возможность реализации прямых эффектов пролактина на почку на основе анализа экспрессии изоформ рецептора пролактина, ключевых белков проведения сигнала пролактина и его терминации в условиях гиперпролактинемии в модели холестаза беременных. Работу проводили на беспородных половозрелых самках крыс следующих групп: интактные, с гиперпролактинемией (ложной беременностью), с холестазом, с холестазом и гиперпролактинемией (модель холестаза беременных). У животных всех групп измеряли уровень мРНК длинной и короткой изоформ рецептора, пролактина STAT5A и STAT5B, FOXO3, GALT, SOCS3 и PIAS3 с помощью ОТ-ПЦР и уровень экспрессии белков STAT5 и pSTAT5 с помощью вестерн – блоттинга в коре и внешнем мозговом слоях почки. Во внешнем мозговом слое почки в группе «холестаз» экспрессия мРНК короткой и длинной изоформ рецептора пролактина возрастает относительно нормы с непропорционально высоким ростом короткой. В условиях холестаза беременных экспрессия короткой изоформы рецептора пролактина снижается относительно группы «холестаз» более сильно, чем экспрессия длинной. В коре почки экспрессия длинной изоформы рецептора пролактина возрастает при холестазе беременных относительно нормы. При холестазе беременных увеличивается экспрессия белкового продукта pSTAT5 по сравнению с нормой во внешнем мозговом слое почки. Во внешнем мозговом слое почки экспрессия генов SOCS3 и PIAS3 возрастает при холестазе беременных по сравнению с интактными животными. В коре в условиях холестаза беременных возрастает экспрессия как SOCS3, так и PIAS3 относительно нормы, кроме того экспрессия SOCS3 возрастает в группе «холестаз» относительно интактных крыс. Экспрессия мРНК GALT снижается при холестазе по сравнению с нормой только во внешнем мозговом слое почки. Полученные данные являются пионерскими и служат доказательством наличия прямых эффектов пролактина на почку, в реализации которых принимают участие обе изоформы рецептора пролактина. Тема 2. Гормональные аналоги избирательного действия Иммунные клетки, рекрутируемые для регуляции процессов размножения в репродуктивные органы и ткани женского организма, в том числе в яичник и плаценту - места синтеза прогестерона, подвергаются действию высоких концентраций этого гормона. Прогестины регулируют процессы в клетках, действуя через ядерные рецепторы стероидных гормонов (nSRs), через мембранные рецепторы прогестерона (mPRs). Остается неясным, через какой тип рецепторов прогестерон и его производные оказывают свое действие на иммунные клетки, насколько одинаковы их эффекты в разных типах этих клеток. Ранее нами были выявлены два селективных лиганда mPRs, не взаимодействующие с nSRs. Целью работы было изучение эффектов прогестерона и новых селективных лигандов mPRs на экспрессию цитокинов про- и противовоспалительного действия в активированных мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) человека, моноцитах линии ТНР-1 и Т-лимфоцитах линии Jurkat. Показано, что прогестерон и селективные лиганды действовали однонаправлено, но в различных типах иммунных клеток оказывали разные, иногда даже противоположные эффекты. В РВМС под действием этих стероидов повышалась экспрессия провоспалительных цитокинов IL-1β, TNFα, IL-6, INFγ, понижалась – IL-2, повышалась экспрессия противовоспалительного цитокина TGFβ, понижалась IL-4 и IL-10. В моноцитах, как в РВМС, повышалась экспрессия IL-1β, TNFα, но экспрессия IL-10 также повышалась, а TGFβ достоверно не менялась. В Т-лимфоцитах Jurkat понижалась экспрессия IL-2 и TNFα, повышалась IL-10, а TGFβ не менялась. Таким образом, прогестины действуют на иммунные клетки через mPRs и оказывают как про-, так и противовоспалительные эффекты в различных клетках в зависимости от их фенотипа. Впервые изученные новые селективные лиганды mPRs перспективны как иммуномодуляторные прогестины, не оказывающие побочного действия на ткани и органы, экспрессирующие nSRs. Полученные результаты важны для понимания сложности регуляции иммунной системы прогестинами, зависящей от типа иммунных клеток и индивидуальных особенностей иммунной системы организма. Тема 3: Пролактиновая ось трехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus в регуляции адаптации и размножения. Закончены подготовительные этапы исследования однодневной пресноводной адаптации самок и самцов из морской популяции трёхиглой колюшки в интактном состоянии и после воздействия блокатора секреции пролактина бромокриптина; исследования однодневной морской адаптации самок и самцов из пресноводной популяции трёхиглой колюшки в интактном состоянии; исследования пролактиновой оси в динамике пресноводной адаптации самок и самцов из морской популяции трёхиглой колюшки. Тема 4: Роль серпинов в канцерогенезе Анализ цитоплазматического и ядерного экстракта методом иммуноблоттинга выявил ядерное накопление ААТ человека, узнаваемого всеми используемыми антителами в условиях денатурирующего электрофореза, в то время как цитоплазматической формы ААТ не детектировано. Ядерная накопление ААТ подтверждено методом иммунофлуоресценции с последующим анализом методом конфокальной микроскопии. Методом ИФА установлено, что С-концевой эпитоп секреторного варианта ААТ спрятан внутри молекулы и не узнается используемыми антителами против С-конца. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что молекула ядерной формы ААТ имеет конформацию, отличную от таковой канонического секреторного варианта.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клеток
Результаты этапа: В крысиной модели холестаза беременных и группах сравнения выявлены основные молекулярные мишени пролактина в отношении транспортеров натрия и бикарбонатов и прямых регуляторов их работы. Это натрий-калий хлорный котранспортер NCC, α-субъединица эпителиального натриевого канала ENaCα, убиквитинлигаза Nedd 4-2, натрий-бикарбонатный обменник NBCe1. Изучено действие новых, выявленных нами, селективных лигандов мембранных рецепторов прогестерона и прогестерона на процессы пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках ВхРС3 аденокарциномы поджелудочной железы человека, экспрессирующих высокий уровень изучаемых рецепторов. Показано, что пролиферация под действием прогестерона и соединения I достоверно снижается при 72-часовой инкубации, особенно при ингибировании р38 МАРК. JNK опосредует действие прогестинов на подавление пролиферации клеток через изменение экспрессии PCNA, циклина D1и р21. Влияние стероидов на гибель опухолевых клеток путем апоптоза и некроза в этот временной период не столь выражено. Мишенями действия изучаемых соединений на процесс апоптоза являются гены DAPK, HRT, Casp9, BAX и BCL2A1. Выявлены половые различия в относительной экспрессии опсинов RH2 и LWS в сетчатке морской морфы колюшки с преобладанием у самок, которые исчезают после суточной адаптации к пресной воде. Показано, что вклад пролактина и пролактинподобного гормона в адаптацию к пресной воде у самок и самцов колюшки существенно различается: у самок достоверно возрастает пролактин-1, а у самцов пролактиноподобный гормон, причем временная динамика их повышения также отличается у разных полов. Установлено, что ядерная форма ААТ отличается от секреторной формы отсутствием N-гликозилирования и большей молекулярной массой. Предполагается, что именно наличие гидрофобного участка в виде сигнального пептида приводит к измененной конформации белка, экспонированию его РНК-связыващего мотива, а также мотива, который предположительно может связываться ядерно-цитоплазматическими белками-транспортерами.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Гормонсвязывающие белки, гормональный ответ и дифференцировка клеток
Результаты этапа: Впервые показано, что экспрессия мРНК общего рецептора пролактина и его изоформ в поджелудочной железе самки крысы снижается при холестазе. Из-за более резкого снижения уровня экспрессии мРНК короткой изоформы рецептора пролактина при холестазе, соотношение экспрессии длинной изоформы РПрл к короткой достоверно возрастает. Установлено, что экспрессия мРНК общего транспортёра NBCe1 и его В изоформы в поджелудочной железе самки крысы увеличивается при холестазе. Экспрессия мРНК CFTR в поджелудочной железе самки крысы в условиях холестаза статистически значимо не изменяется. Установлено, что содержание ионов [Na+] в сыворотке крови самцов и самок трехиглой колюшки уменьшается при суточной и трёхсуточной пресноводной адаптации, а содержание ионов [K+] не изменяется. Подтверждены результаты прошлых экспериментов, согласно которым ген пролактинподобного гормона Prl2 экспрессируется только в мозге самцов на 12 и 18 часу пресноводной адаптации. Экспрессии данного гена не наблюдается у самцов в условиях морской воды и после 18 часа пресноводной адаптации, а также у самок. Продемонстрировано, что 2 соединения, выявленные нами как селективные лиганды мембранных рецепторов прогестерона, аналогично прогестерону усиливают активирующее фосфорилирование киназ р38 МАРК и JNK. Обнаружено дифференцированное действие этих стероидов на процессы апоптоза опухолевых клеток. Прогестерон и соединение I (19-гидроксипрегн-4-ен-20-он) усиливали фрагментацию ДНК в клетках, в то время как соединение II (19-гидроксипрегн-3-ен-20-он) увеличивало манифестацию фосфатидилсерина на наружной мембране клеток и повышало их проницаемость к йодистому пропидию при более коротких сроках инкубации. На фоне ингибиторов р38 МАРК и JNK влияние гормонов на эти процессы существенно изменялось. Установлено, что внутриклеточные формы альфа-антитрипсина (в частности С-концевой пептид ААТ, кодируемый экзоном 5 гена SERPINA1) необходимы в процессах, связанных с активной клеточной пролиферацией.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".