Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибовНИР

Ecology, biodiversity, genetics and moleculare methods of monitoring and identification of plant pathogenic fungi

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа: Методы работы. Выделение изолятов в чистую культуру – с использованием влажных камер и селективных сред. Определение видов – по морфолого-культуральным признакам и последовательностям нуклеотидов участков генома с помощью специфических ПЦР-праймеров и секвенирования последовательностей. Тестирование устойчивости к фунгицидам – по скорости радиального прироста колонии на агаризованной питательной среде с добавлением разных концентраций соответствующих фунгицидов относительно среды без добавления фунгицида. 1.В отчетном году проводилось тестирование структуры геноспецифичных локусов ДНК и устойчивости к фунгицидам штаммов Colletotrichum coccodes, Thanatephorus cucumeris и Helminthosporium solani. Исследован механизм устойчивости российских штаммов Helminthosporium solani к фунгициду тиабендазол. Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes – закончено тестирование 52 штаммов, выделенных из пораженных образцов, собранных в Костромской, Владимирской, Московской областях, Республике Марий Эл, а также из импортированных в Россию из Германии и Голландии клубней семенного картофеля. Все штаммы C. coccodes охарактеризованы по последовательностям нуклеотидов ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS), а также по морфолого-культуральным признакам. Изучена устойчивость штаммов к фунгицидам тиабендазол, пенцикурон, азоксистробин, дифеноконазол, флудиоксонил, модифицированное коллоидное серебро. Оценка устойчивости к фунгицидам на агаризованной среде (табл. 3) показала, что хорошим фунгистатическим действием обладали все препараты за исключением пенцикурона. Очень высокую эффективность показали флудиоксонил и дифеноконазол, для них показатель ЕС50 не превышал 1 мг/л. Меньшую эффективность в ограничении радиального прироста колоний показали серебро, азоксистробин и тиабендазол. Штаммы, сильно отличающиеся по уровням устойчивости (ЕС50), были выявлены в отношении тиабендазола и азоксистробина. Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk (название анаморфной стадии Rhizoctonia solani) – исследованы 14 штаммов, выделенные из пораженных образцов, собранных в Костромской и Владимирской областях, а также из импортированных в Россию из Германии и Голландии клубней семенного картофеля. Все штаммы T. cucumeris охарактеризованы по последовательностям нуклеотидов ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS), а также по морфолого-культуральным признакам. Изучена устойчивость штаммов к фунгицидам тиабендазол, пенцикурон, азоксистробин, дифеноконазол, флудиоксонил, модифицированное коллоидное серебро. Изучение устойчивости R. solani к фунгицидам показали, что фунгицидным действием обладали флудиоксонил (Максим) и пенцикурон (Престиж) (таблица 5). Однако в природных популяциях России были найдены высокоустойчивые к Престижу штаммы грибов. К препарату Максим в лабораторных условиях довольно легко появлялись устойчивые формы грибов. Коллоидное серебро (Зерокс) показал себя хорошим фунгистатиком, азоксистробин (Квадрис) оказал довольно слабое воздействие на R. solani. Helminthosporium solani Dur. et Mont – 21 штамм, выделенный из пораженных образцов, собранных в Брянской, Костромской, Московской областях, Республике Чувашия, а также из импортированных в Россию из Германии и Голландии клубней семенного картофеля. Все штаммы охарактеризованы по структуре ДНК участка ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS), по морфологическим параметрам, по устойчивости к фунгицидам тиабендазол, азоксистробин, дифеноконазол, модифицированное коллоидное серебро. Изучение устойчивости H. solani к фунгицидам показало, что высокой фунгицидной эффективностью обладал только дифеноконазол (Скор) (таблица 7). К тиабендазолу (Текто, Вист) и азоксистробину (Квадрис) выявлена довольно высокая доля высокоустойчивых штаммов. Препарат Зерокс на основе коллоидного серебра показал хороший фунгистатический эффект. Тиабендазол связывается с грибным β-тубулином и ингибирует работу аппарата микротрубочек, что приводит к смерти гриба. Мутации в гене β-тубулина приводит к появлению устойчивости. В нашей работе структура гена β-тубулина была определена у 16 различающихся по устойчивости к тиабендазолу российских и европейских штаммов. Все исследованные последовательности, принадлежащие чувствительным штаммам, оказались одинаковыми и полностью совпали с последовательностью Genbank Y10670 (McKay, Cooke, 1997), характерной для гена β-тубулина чувствительных к тиабендазолу штаммов. Высокоустойчивые штаммы RMCh24, H16 и RMCh2 содержали однонуклеотидные замены в гене β-тубулина. 2. В 2016 году были выделены в чистые культуры 7 изолятов Colletotrichum coccodes из стеблей картофеля и 4 изолята из листьев картофеля. В нашей работе такое выделение удалось провести впервые; в листьях и стеблях Colletotrichum coccodes встречается редко, в мировых коллекциях представлены только штаммы, выделенные из клубней или из почвы. Также были выделены 8 изолятов из клубней картофеля, собранных на разных полях Московской области. В настоящее время проводится анализ молекулярных и биологических свойств этих изолятов. Была продолжена работа по выделению штаммов Helminthosporium solani. Выделены 20 изолятов из клубней, выращенных в Московской, Костромской областях и в Чувашии из отечественного и импортированного семенного материала. Выделены и помещены в коллекцию 5 изолятов Fusarium sp. со стеблей картофеля. Также коллекция пополнена 11 штаммами мелоспоровых Alternaria, выделенными из клубней и стеблей картофеля. Из выращенных в Белоруссии клубней выделены 4 изолята пока неидентифицированных оомицетов (по-видимому, рода Pythium), вызывающих массовые поражения клубней при хранении, а также 8 изолятов Helminthosporium solani. Всего в отчетном году выделен и заложен в коллекцию 71 изолят. Из Калининградской области привезены фиксированные образцы (25 штук) пораженных и здоровых листьев томата для изучения видового разнообразия молекулярно-генетическими методами. 3. С помощью тест-системы (Cullen et al., 2002) для идентификации вида Colletotrichum coccodes исследовано 74 фиксированных пораженных образцов листьев картофеля из областей Центра и Северо-Запада России: Новгородская обл. (исследовано 9 образцов), Карелия (11), Вологодская обл. (12), Костромская обл. (15), Московская обл. (27), Марий Эл (1). Присутствие C. coccodes было выявлено в 2-х образцах листьев картофеля: 1 из Костромской области и 1 из Марий Эл.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа: Методы работы Выделение изолятов в чистую культуру – с использованием влажных камер и селективных сред. Определение видов – по морфолого-культуральным признакам и последовательностям нуклеотидов участков генома с помощью специфических ПЦР-праймеров и секвенирования последовательностей. Тестирование устойчивости к фунгицидам – по скорости радиального прироста колонии на агаризованной питательной среде с добавлением разных концентраций соответствующих фунгицидов относительно среды без добавления фунгицида. Результаты этапа 2017 года 1. Обработано 70 проб из 14 сборных образцов картофеля, моркови и свеклы из Московской области. Методом влажных камер выделены и определены 24 штамма грибов. Среди них были такие фитопатогенные виды, как Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides и др. В Костромской области были специально высажены выращенные на аэропонике клубни картофеля сорта Ред Скарлетт. В настоящее время ведется выделение из них чистых культур грибов. В Краснодарском крае были собраны для анализа образцы пораженных плодов томата и клубней картофеля. Из плодов томата были выделены чистые культуры штаммов рода Alternaria и 2 изолята Colletotrichum coccodes. Впервые были выделены биотрофные паразиты рода Cladosporium из листьев томата, собранных в Московской области. Чистые культуры Rhizoctonia solani, Helminthosporium solani, Fusarium solani были выделены из клубней картофеля, приыезенных из Магаданской области. 2. Для штаммов Colletotrichum coccodes были определены последовательности 4х регионов ДНК ядерных рибосомных генов и межгенных внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS), генов глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPD), глутамин-синтетазы (GS) и актина (ACT). Для проведения молекулярно-генетического анализа были отобраны изоляты из разных частей растения картофеля (клубни, стебли, листья), выделенные из образцов, собранных в разных регионах. У выбранных штаммов определили последовательности нуклеотидов ITS, GAPD, GS и ACT (рис.1). Последовательности ACT всех 43 исследованных штаммов были одинаковыми (сиквенс депонирован в Genbank под номером KY496631) и совпали с имеющимся в Genbank сиквенсом HM171667 (изолят CBS 369.75, Liu et al., 2013). Последовательности ITS 44-х исследованных штаммов разделились на две группы: одна группа включала штаммы, выделенные со всех трех типов субстрата (клубневые, листовые и стеблевые), тогда как вторая группа содержала только клубневые изоляты из Германии. Разница между кластерами составляла один нуклеотид; штаммы одной из групп (KY496632) полностью совпадали с сиквенсом HM171678 (изолят CBS 164.49, Liu et al., 2013), сиквенс штамма представителя другой группы депонирован под номером KY496633. Последовательности нуклеотидов GAPD 48-и исследованных штаммов также разделились на 2 группы, различающиеся 2-мя нуклеотидами (депонированные сиквенсы KY496634 и KY496635), причем каждая группа включала в себя изоляты из России и Германии со всех типов субстрата. Оба сиквенса полностью совпали с имеющимися в Genbank: один – с последовательностью JX546727 (изолят CBS 125.57) (Liu et al., 2013), а второй – с HM171672 (изолят CBS 164.49) (Liu et al., 2013). Последовательности нуклеотидов гена GS 42-х штаммов (депонированные сиквенсы KY524295 и KY524296) также разделились на две группы, отличающиеся 2-мя нуклеотидами, но все листовые изоляты объединились в одну группу, тогда как изоляты из клубней и стеблей картофеля присутствовали в обеих группах. Проведенные исследования показывают слабую внутривидовую вариабельность штаммов изучаемого фитопатогена, выделенных с листьев, клубней и стеблей картофеля. В отчетном году были выделены изоляты C. coccodes из пораженных плодов томата. Обнаружено, что последовательности ДНК штаммов, выделенных с плодов томата, существенно отличаются от штаммов, выделенных с картофеля по сиквенсам исследованных генов. В отчетном году были исследованы штаммы Rhizoctonia solani, выделенные с клубней картофеля в предыдущие годы. Анализ принадлежности штаммов к группам вегетативной совместимости проводили с помощью праймеров, сконструированных Kuninaga et al, 2000. Эти праймеры позволяют избирательно амплифицировать участок ДНК, соответствующий группе AG-3 Rhizoctonia solani. С помощью данных праймеров были обнаружены штаммы группы AG-5. У части коллекционных штаммов были определены последовательности ITS регионов рДНК штаммов Rhizoctonia solani. Филогенетический анализ полученных последовательностей методом максимального правдоподобия выявил разделение изучаемых штаммов на несколько кластеров, выявив принадлежность большей части штаммов к группе AG-3. Отдельную ветвь образовал штамм, принадлежащий к группе AG-5. Промежуточное положение занял штамм GDe8, часть нуклеотидных замен которого, сближала его со штаммами AG-5 группы, а другая часть – со штаммами группы AG-3. Исследованные штаммы были генетически неоднородны и внутри этих групп. Так, R12M1PT3 имел замену T→C в 163 и T →A в 164 позиции. Штаммы GSa7/2, R12S2PT8, R13M3PT22, 14VMrs3, GDe21, 14Ksman18, 14Ksman18, R12S2PT32 имели транзицию G→A в 117 позиции, дополнительно штамм GSa7/2 обладал трансверсией G→C в 370 позиции, и R12S2PT8 – транзицией Т→С в 400 позиции. Штамм GDe8 выделился в отдельную подгруппу внутриAG-3 группы, благодаря целому ряду замен, часть которых характерная для AG-5 группы. При этом в Генбанке были обнаружены совпадения последовательностей со штаммами с такими же заменами, описанными как AG-3 в Китае и Франции. Полученные данные позволяют предположить наличие нескольких генотипов штаммов AG-3 группы. Внутри AG-5группы также наблюдался полиморфизм. Штаммы различались наличием следующих замен: C→T в 135, A→G в 375, T→C в 429, G→A в 543 и A→C в 562 позиции. Какой-либо связи генотипического разнообразия с географией мест сбора не было выявлено. Из образцов клубней картофеля, собранных в Беларуси, были выделены 4 штамма возбудителей раневой водянистой гнили. Анализ последовательностей нуклеотидов видоспецифичных участков генома (ITS) с помощью праймеров ITS1 и ITS2 показал принадлежность изучаемых штаммов к виду Pythium ultimum Trow. Все исследуемые штаммы поражали помещенные во влажные камеры ломтики клубней картофеля сорта Гала. На них образовывались темные пятна, позже переходящие во влажные глубоко проникающие язвы. Скорость роста штаммов оценивали на овсяной агаризованной среде при температурах 5, 15, 24 и 34°С. Рост наблюдался при всех температурах; максимальная скорость роста отмечена при 24°С (чашка 86 мм полностью зарастала за 2 суток). При 15 и 34°С скорость роста была существенно ниже (чашка зарастала за 4 и 3 суток соответственно). При температурах 15, 24 и 34°С скорости роста всех исследуемых штаммов не различалась. При температуре 5°С штамм Р1 рос существенно быстрее других (20 мм на 4 сутки), Р4 – несколько медленнее (10 мм на 4 сутки), Р2 и Р3 практически не росли. Следует также отметить, что при температуре 24°С рост начинался сразу после посадки на чашку, при температурах 15 и 34°С была задержка начала активного роста на 1 сутки, а при 5°С – на 2 суток. Металаксил (и его изомер мефеноксам) признаются как наиболее действенные препараты для контроля почвенных оомицетов. Данных об устойчивости белорусских штаммов P. ultimum к металаксилу нет, в связи с чем было решено протестировать их устойчивость к препарату в настоящей работе. Исследование восприимчивости к фунгициду металаксил проводили на овсяной агаризованной среде с добавлением фунгицида в разных концентрациях (Побединская, Еланский, 2014). Исследованные штаммы имели некоторые различия в устойчивости к металаксилу. Так, при концентрации фунгицида, равной 1 мг/л, рост штамма P4 полностью прекращался, а остальных штаммов – сильно замедлялся. Штаммы Р1 и Р2 очень медленно росли на среде с концентрацией металаксила 10 мг/л. Рассчитанная эффективная концентрация ЕС50 (концентрация фунгицида, замедляющая скорость роста штамма в 2 раза относительно контроля) для всех штаммов была менее 1 мг/л. Таким образом, все исследованные штаммы были восприимчивы к металаксилу; он показал высокую эффективность в подавлении роста P. ultimum. При росте на овсяной среде все штаммы образовывали ооспоры в монокультуре, что типично для P. ultimum. Попарное сращивание штаммов не выявило видимых симптомов вегетативной несовместимости – чашки были равномерно покрыты мицелием. Полученные данные свидетельствуют о том, что P. ultimum – фитопатоген, способный к быстрому росту в широком диапазоне температур, в том числе при температуре хранения 5°С. Он является вирулентным для тканей клубней картофеля и образует ооспоры, способные к длительному сохранению жизнеспособности. Таким образом, вид является опасным фитопатогеном, который может представлять угрозу сельскому хозяйству и нуждается в дополнительном изучении. 3. С помощью метода рестрикционного (RFLP) анализа и праймеров, известных литературы (Judelson et al., 1995) проводились эксперименты по определению А1 и А2 типов спаривания Phytophthora infestans. При амплификации образуются фрагменты 557 п.о. у каждого из типов спаривания. После обработки рестриктазой HaeIII изоляты A2 типа образовывали фрагмент размером 457 п.о.Два фрагмента 457 и 557 п.о. наблюдались у изолятов A1. Нами было проанализировано 34 штамма P. infestans, выделенных из пораженных органов картофеля, томата и Solanum dulcamara в разных регионах России (Костромская, Рязанская, Астраханская, Московская области). Результаты ПЦР-анализа с помощью специфичных праймеров на 90% совпали с результатами анализа типа спаривания традиционным способом на питательной среде.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа:
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".