Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологийНИР

Ecological physiology, cytology and genetics of fungi as the base of rational nature management and biotechnology

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий
Результаты этапа: Проведены выделение и идентификация галоалкалотолерантных видов грибов из засоленных почв, и исследования по выявлению бактериальных ассоциантов алкалофильных микромицетов. Определены закономерности изменения состава липидов мембран и углеводов цитозоля у строгих алкалофилов рода Sodiomyces к снижению кислотности среды и их значение в адаптации к этому стрессу. У отобранных ранее активных штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов оценена алкалостабильность внеклеточных протеаз и их активность при различных температурах. Получены сведения о микобиоте глубоководных илов Белого моря и исследована антибиотическая активность грибных штаммов из этого местообитания, отобрано 5 активных штаммов. Изучены трофические предпочтения штаммов Qaumbalaria cyanescens, изолированных с мужских сережек пыльцы березы, и влияние источников азота и углерода в среде на рост и жизненный цикл гриба (переход к дрожжевой стадии). Цитологическое изучение ассоциации грибов Trichaptum fusco-violaceum, T. pargamenum, Stereum hirsutum и Cerrena unicolor и водорослей выявило локализацию фототрофных про- и эукариотных микроорганизмов и гетеротрофных бактерий на поверхности ив их плодовых телах, получены данные о характере их взаимоотношений. Исследованы механизмы, обеспечивающие поддержание жизнеспособности трутовика S. hirsutum на среде без внесения азотсодержащих соединений. Охарактеризована зависимость биологического возраста мицелия Podospora anserina от стадии роста колонии, температуры хранения. Проверена гипотеза о стабильности биологического возраста P. anserina вплоть до гибели мицелия в последнем пассаже. Отработана методика по исследованию ультраструктуры P. anserina. Получены данные о необратимой изменчивости аскомицетного гриба P. anserina (Rabenh.) Niessl при непрерывном поддержании роста мицелия на жидкой питательной среде. Установлено, что физиологически измененных линий P. anserina не формируют плодовых тел даже после прохождению жизненного цикла в условиях, приближенным к естественным.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий
Результаты этапа: Описаны изменения биоты грибов в фитоценозах вторичной сукцессии при зарастании сельхозугодий в южной тайги. Изучен состав грибов в гиперсоленых почвах с хлоридным типом засоления и исследован их характер адаптации к рН, температуре и хлористому натрию. Определено изменение состава липидов мембран и растворимых углеводов цитозоля у штаммов алкалотолерантных видов при повышении рН в среде. Оценена стабильность и активность протеаз в щелочных условиях и повышенном содержании хлорида натрия у алкалофилов и алкалотолерантов. У микромицетов из морских илов определена скорость роста на различных источниках углерода, при гипоксии, пониженных температурах и разной концентрации хлорида. Отобраны новые изоляты с антигрибной активностью и штаммы базидиомицетов с высокой антиоксидантной активностью. Методом иммунного дот-блоттинга и иммуно-выявляемых маркеров старения и оксидативного стресса получены новые данные по изменению биологического возраста грибов Stereum hirsutum, Podospora anserina и Cordiceps militaris при их росте на твердых средах. Для Podospora anserina впервые установлено распределения поврежденных белков в прорастающих аскоспорах, отработан метод выявления митохондрий и определены особенности их распределения в мицелии Stereum hirsutum и Coprinus comatus, методы хранения базидиомицетов при низких температурах. получены сведения о функционировании дыхательных электрон-транспортных цепей у базидиомицетов при среде Чапека и при дефиците азота или углерода.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий
Результаты этапа: Продолжено исследование соле- и щелочеустойчивых грибов в прибрежной зоне содовых озер, литорали и донных грунтов морей Северного Ледовитого и Атлантического океанов. Проведено выделение таких грибов из собранных образцов и коллекция пополнена на 200 культур, около половины из которых идентифицировано с использованием морфолого-культуральных и генетических признаков. Исследованы in vivo культуры грибов в ассоциациях с другими организмами (бактериями). Для Sodiomyces alkalinus показана тесная связь с бактериями и, по-видимому, он использует в качестве источников питания бактерии и ракообразных, что согласуется с местами его обнаружений, которые близки к воде и полностью лишены растительности. Описан новый Sodiomyces-тип развития плодовых тел, который имеет конвергентное сходство с морскими грибами. Изучена динамика растворимых углеводов цитозоля и мембранных липидов у факультативно алкалофильных грибов Emericella alkalina и Sodiomyces tronii в ответ на изменение pH среды и тепловой шок, соответственно. Обнаружен низкий уровень трегалозы в цитозоле E. alkalina, основными сахарами являются маннит и арабит. В кислых условиях преобладает маннит, в высокощелочных – арабит. Значимых изменений в составе мембранных липидов в при разных значений pH среды у E. alkalina не наблюдали. В контрольных условиях состав углеводов у Sodiomyces tronii представлен трегалозой (48-56% от суммы сахаров), а также глюкозой и маннитом. При тепловом шоке, ингибируется синтез маннита; содержание трегалозы и глюкозы остается на высоком уровне, значительных изменений в липидном составе мембран не обнаружено. Изучена способность 22 штаммов Emericellopsis alkalina из коллекции грибов экстремальных местообитаний к синтезу новых противогрибных пептаиболов (А118-37 и его гомологов). Для нового пептаибола А118-37, названного эмерициллипсином А, выяснена молекулярная формула и охарактеризована структура. Эмерициллиписин А - линейный пептид, образует альфа-спираль, молекулярная формула C54H99N9O11 с изотопной молекулярной массой 1049.746. Получены данные о противогрибковой активности эмерициллиписина А в отношении клинических штаммов. Внеклеточные алкалостабильные протеазы у 4-х штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов (Sodiomyces alkalinus F10, Gibellulopsis nigrescens MAG21, Chordomyces. antarcticum M27 и V213) сохраняют высокие активности не только при 30%-ном содержании хлорида натрия в среде, но и устойчивы к воздействию ионного (SDS) и неионного (Triton-100) детергентов, что важно для их практического применения. Продолжено изучение микроскопических грибов, изолируемых из морских грунтов Белого моря и других морей. Выделено 70 видов, которые относились к 26 родам, 18 семействам, 10 порядкам, 8 классам и 3 отделам. Установлены грибы, способные развиваться в условиях низких температур, лимитации по кислороду и на различных органических субстратах (крахмал, целлюлоза, хитин, таллом ламинарии) в донных грунтах in vitro. Физиологическая характеристика изолятов этих видов показала, что все они галотолерантные, многие с оптимумами роста на среде с содержанием хлорида натрия как в морской воде, большинство из них психротолерантные, многие факультативные анаэробы, и все могут разлагать субстраты, поступающие в морские грунты. Высокая антимикотическая активность обнаружена у морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) при росте, как на твердых, так и жидких средах, и связана она, по предварительным данным, с активным синтезом циклоспоринов. Установлен состав грибов (Acremonium spp., Oidiodendron spp., Bionectria sp. (anam. Clonostachys sp.), Pleosporales, Alternaria alternate, Trichoderma spp., Mucor sp.), развивающихся и, видимо, мацерирующих Sphagnum fallax, доминирующем на болотах в подзоне крайней северной тайги (Республика Коми). Проведен сбор более 80 плодовых тел макромицетов и выделение из них чистых культур, их идентификация и депонирование в GenBank ITS-последовательностей (14 штаммов трутовых грибов). Филогенетический анализ штаммов коллекции из рода Ganoderma и вида Fomitopsis pinicola на основе ITS- последовательностей кластера генов рРНК показал высокий уровень генетического полиморфизма для штаммов Ganoderma и относительный консерватизм ITS локуса у трутовика окаймленного F. pinicola. на территории Европейской части России, Финляндии и Франции. Продемонстрирована возможность использования минисателлитных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации штаммов F. pinicola. Охарактеризованы группы вегетативной несовместимости для природных штаммов трутовика окаймлённого. Наибольшую противоопухолевую активность проявили метанольные экстракты трех видов – F. pinicola, I. obliquus и T. versicolor – с эффективной концентрацией препарата не менее 50 мкг/мл. Тесты на цитотоксичность показали перспективность экстрактов грибов Fomitopsis pinicola (штамм Fp-7) и Trametes versicolor (штамм It-1) как противоопухолевых агентов. Изучены особенности циклов развития и формирования базидиом 4-х видов базидиальных макромицетов из разных эколого-трофических групп: гумусовых сапротрофов – шампиньоны двуспоровый и двукольцевой Agaricus bisporus и A. bitorquis, ксилотрофов – вешенка устричная Pleurotus ostreatus и зимний опенок Flammulina velutipes. Проверены на жизнеспособность мицелиальных культуры базидиомицетов, штаммы которых заложены на хранение в 2015 году. Требуется дальнейшая оптимизация условий длительного хранения макромицетов, в первую очередь, учет влияния криопротекторов на их морфолого-культуральные характеристики, для чего заложен новый долгосрочный эксперимент с разными концентрациями криопротектора (глицерина). Методами флуоресцентной и электронной микроскопии исследован эндоцитоз у фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani. Данные, полученные микроскопическими методами, позволяют предположить существование его нескольких путей: микропиноцитоз (размер везикул до 20 нм) и макропиноцитоз (размер поглощенных везикул от 20-200 нм). Классический микропиноцитозный путь включает инвагинацию плазматической мембраны, формирование везикул, ранних и поздних эндосом, и деградацию поглощенного «груза» в вакуолях, либо возврат (рециклинг) компонентов плазмалеммы. Начальные этапы этого пути на структурном уровне можно наблюдать с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Эндоцитоз может идти по макропиноцитозному пути, когда происходит захват более крупных полимерных молекул, которые могут транспортироваться в эндосомах к вакуолям грибной клетки, где происходит их гидролиз до мономеров. Продолжается длительный, к настоящему времени 6,5-летний эксперимент по поддержанию гриба Podospora anserine в активном растущем состоянии. Независимые линии культуры, полученные в таких условиях, показали себя как морфологически стабильные, быстро набирающие биомассу, сохраняющие способность метаболизировать широкий круг субстратов, включая сложные (казеин), не требующие специфических условий для своего роста, устойчивые к стрессу (добавление NaCl). Были сделан ряд дополнительных наблюдений за формированием, благодаря инвагинации цитоплазматической мембраны, двумембранных везикул P. anserina. Оказалось, что двумембранные везикулы не являются специфичными для экспериментальных линий, а присутствуют и у контрольных штаммов P. anserina, из которых наши линии были получены. Однако в клетках контрольных штаммов везикулы с двумя мембранами встречаются реже, и их сложнее заметить из-за более высокой электронной плотности цитоплазмы и обилия мелких одномембранных вакуолей. В работе по подбору эффективных маркеров грибного старения начаты исследования возможности применения антител к HNE - продукту пероксилипидной модификации белков. Были также обнаружены и устранены серьезные технические ошибки в используемом ранее иммунологическом методе полуколичественного анализа других маркеров грибного старения (карбонилированных белков).
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий
Результаты этапа: Работы по теме «Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий» имеют фундаментальное и прикладное значение. Продолжено исследование микобиоты в наземных и водных экосистемах, с акцентом на экстремальные экотопы, с целью характеризовать таксономию, экофизиологию, биохимические механизмы адаптации, жизненные циклы, связи с грибов другими организмами, участие в деструкции органических веществ и синтезе биологически активных соединений. Впервые изучали состав щелочеустойчивых грибов в экотопах нейтрального засоления (побережье хлоридного озера Баскунчак). Идентифицированы 55 культур микромицетов по морфолого-культуральным признакам, 40 культур с применением молекулярно-генетических методов, проведен филогенетический анализ и исследован характер адаптации к факторам pH, солености у представителей разных таксонов. Выполнен микологический анализ образцов песчаного грунта литорали Балтийского, Баренцева и Белого морей. Грибы выделены в чистую культуру, получены моноспоровые изоляты. Разнообразие грибов в песчаных грунтах исследованных морей не высоко. Общей особенностью является большая доля темноокрашенных грибов, и в разных морях доминируют различные виды. Изучен состав грибов, ассоциированных с красной водорослью Palmaria palmata, произрастающей в Кандалакшском заливе Белого моря. Всего выделен 461 изолят – 403 мицелиальных и 58 дрожжевых грибов. Обнаружены облигатно-морские виды: Acremonium fuci, Cladosporium salinae, Paradendryphiella arenaria и P. salina. Начат комплексный анализ микобиоты арктических морей России - Лаптевых, Восточно-Сибирского и Карского. Проведены посевы образцов на питательные среды на основе морской воды и микроскопические наблюдения грибов с помощью окрашивания люминесцентными красителями Calcofluor White, DAPI. Визуально подтверждено присутствие грибов во всех изученных морских субстратах – как в пелагиали в качестве ассоциантов с фитопланктоном, так и в донных осадках в виде активно развивающегося мицелия, в том числе в области метановых сипов и на глубинах до 3000 м. Продолжено выявление особенностей физиологии щелочеустойчивых изолятов коллекции для выяснения типа адаптации к фактору рН, солености, температуре для выяснения типа адаптации к этим факторам. Такие данные получены как для изолятов с побережья соленых озер, так и для изолятов, колонизирующих штукатурку и камень, которые продемонстрировали алкалотолерантный и алкалофильный тип адаптации. Проведено исследование динамики растворимых углеводов цитозоля и мембранных липидов у факультативно алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina в ответ на изменение концентрации хлористого натрия в среде. Показана ключевая роль осмолитной системы в процессе адаптации гриба к осмотическому фактору путем накопления эритрита, тогда как участие мембранных липидов в этом процессе невелико. Исследован спектр антимикробной активности нового липопептида – эмерициллипсина А, выделенного из алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina. Зарегистрирована способность эмерициллипсина А подавлять рост патогенных грибов – возбудителей тяжелых и хронических микозов. Подобраны условия биосинтеза и состав питательной среды, обеспечившие более высокий уровень накопления пептида в среде. Все изоляты E. alkalina, в отличие от других исследованных видов рода Emericellopsis, способны к синтезу эмерициллипсина А. Выход продукта значительно варьирует в зависимости от изолята E. alkalina, некоторые изоляты Emericellopsis способны к продукции гомологов и/или других пептаиболоподобных компонентов. Внеклеточные протеазы 2-х штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов (Sodiomyces alkalinus F10 и Chordomyces antarcticum M27) сохраняют высокий уровень активности не только при 30%-ном содержании хлорида натрия и рН среды 9-10, и устойчивы к воздействию ионного (SDS) и неионного (Triton-100) детергентов, но и при введении в среду окисляющего соединения (перекиси водорода), коммерческого детергента Ariel или жидкого пятновыводителя Vanish Oxi Action. Это свидетельствует о хороших потенциальных возможностях практического применения внеклеточных протеаз этих грибов. Продолжено изучение состава и метаболической активности микроскопических грибов, изолируемых из морских грунтов морей Северного Ледовитого океана. Получены первые данные о пуле грибной биомассы в донных грунтах северных морей (Карского моря). Микроскопические грибы - представители рода Tolypocladium, характерные для морских донных грунтов, способны с высокой активностью к анаэробному восстановлению нитратов с образованием закиси азота, и это показано впервые. Существенно ниже скорость выделения закиси азота в анаэробных условиях продемонстрировали морские штаммы видов Trichoderma polysporum, T. harzianum, Emericellopsis sphaerospora, Penicillium solitum Westling, Penicillium montanense, остальные из протестированных 18 штаммов разных видов (Umbelopsis vinacea, Lecanicillium lecanii и ряд других) не образовывали закись азота. Обнаружение довольно высокой активности выделения закиси азота грибами в условиях лимитации снабжения кислородом указывает на необходимость оценки этого процесса непосредственно в донных грунтах, также при использовании грибами нитритов в качестве акцепторов электронов. Подтверждена высокая антимикотическая активность у морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) при росте, как на твердых, так и жидких средах, и установлено, что связана она с активным синтезом циклоспоринов. Продукция циклоспоринов морскими штаммами вида T. inflatum установлена впервые. Проведены сборы более 70 плодовых тел макромицетов из разных регионов европейской части России, выделение их в чистые культуры и идентификация. Подтвержден видовой статус 38 штаммов гомобазидиальных грибов, отобранных для последующей оценки эффективности утилизации органических субстратов - отходов производств. Подобраны праймеры для молекулярно-филогенетического анализа родов Ganoderma и Pleurotus. Филогенетический анализ штаммов коллекции из рода Ganoderma и вида Fomitopsis rosea на основе ITS- последовательностей кластера генов рРНК показал, что виды рода Ganoderma характеризуются высоким генотипическим разнообразием, и природные штаммы коллекции четко разделяются на клады согласно их видовой принадлежности. Изучены особенности роста и морфогенеза при культивировании Agaricus bisporus штамм Sylvan A15 в случае внесения в компост добавок белкового и углеводного питания на основе отходов сельского хозяйства. Установлено пролонгированное действие подобранных композитных добавок на плодоношение шампиньона, которое выражалось в увеличении массы плодовых тел или их численности, в отдельных случаях урожайности гриба. Продолжен долгосрочный эксперимент по хранению чистых культур макромицетов при разных концентрациях криопротектора (глицерина). Установлено, что при первичной закладке нового штамма концентрации глицерина должны быть 5 и 30%. Это позволит минимизировать риск потери штамма. Для длительного хранения штамма необходим подбор оптимальной концентрации глицерина. Разработана тест-система, включающая две митохондриальные флуоресцентные пробы и протонный разобщитель, позволяющая у мицелиальных базидиомицетов эффективно метить митохондрии и определять их поляризованность. Это впервые приблизило уровень исследований грибных митохондрий грибов к таковому с митохондриями в клетках животных. С помощью этой тест-системы подтверждено наличие у ксилотрофных базидиомицетов сверхдлинных (длиной до 100 мкм и более), нитевидно-сосудовидных разветвленных митохондрий, тянущихся вдоль гиф. Сверхдлинные митохондрии присутствуют только в мицелии ксилотрофных грибов, и их количество лишь в малой степени зависит от питательной ценности субстрата. Они поляризованы, хотя не так сильно, как палочковидные митохондрии у нексилотрофного вида Coprinus comatus. Молодые сверхдлинные митохондрии несут кристы, но при созревании теряют последние и могут превращаться в длинные полые двух-мембранные трубки. Предположено, что сверхдлинные митохондрии ксилотрофов несут переменную функцию: сначала дыхательную, затем - тубулярно-транспортную, участвуют в перемещении внутриклеточных ресурсов на дальние расстояния. Сверхдлинные митохондрии вкупе с другими приспособлениями позволяют дереворазрушающим грибам успешно колонизировать и использовать древесный субстрат, недоступный для большинства других микроорганизмов. Продолжается длительный, к настоящему времени 7,5-летний эксперимент по поддержанию гриба Podospora anserine в активном растущем состоянии. В геномах культивируемых экспериментальных линий Podospora anserina в 2019 году были обнаружены новые мутации. Их распределение оказалось крайне неравномерным: в двух из восьми линий добавилось по 2 новые мутации, в то время как в одной из линий было найдено 60, что может быть эффектом появления гена-мутатора. Выявлено обогащение несинонимическими мутациями, заменяющими аминокислоту в соответствующем белке. В работе по подбору маркеров грибного старения после доработки методики иммунного дот-блотинга, были установлены особенности влияния оксидативных агентов на накопление карбонилированных белков в грибном мицелии. Если при воздействии оксидативных агентов на живые организмы считается, что маркеры гипероксидации должны быть завышенными. Однако для грибов установлено, что при определенных условиях ситуация может быть прямо противоположной. Грибы очищают свои клетки от маркерных молекул в ответ на оксидативное воздействие.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".