|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологийНИР
Ecological physiology, cytology and genetics of fungi as the base of rational nature management and biotechnology
- Руководитель НИР: Кураков А.В.
- Участники НИР: Биланенко Е.Н., Бондаренко С.А., Винер И.А., Воронко О.В., Гарибова Л.В., Георгиева М.Л., Камзолкина О.В., Кудрявцева О.А., Лихачев А.Н., Мажейка И.С., Шнырева А.В.
- Подразделение: Кафедра микологии и альгологии
- Срок исполнения: 1 января 2016 г. - 31 декабря 2020 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 26-3-16
- Номер ЦИТИС: АААА-А16-116021660088-9
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Общая биология и экология
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к экологически чистой и ресурсосберегающей энергетике
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Технологии мониторинга и прогнозирования состояния окружающей среды, предотвращения и ликвидации ее загрязнения
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.27.17 Морфология и физиология микроорганизмов
- 34.27.29 Биология возбудителей заболеваний человека и животных
- Классификатор OECD: Микология, Сохранение биологического разнообразия, Микробиология
-
Ключевые слова:
цитология и генетика грибов, экофизиология, биологически активные метаболиты, экстремальные местообитания
extreme habitats, ecological physiology, genetics and physiology of fungi, biologically active metabolites -
Описание:
В рамках темы будут исследоваться физиолого-биохимические цитологические и генетических особенностей грибов из разных эколого-трофических групп. Будут получены новые данные о составе и функциональных механизмах приспособления грибов экстремальных местообитаний; новые сведения о генетике и метаболических возможностях грибов в том числе дереворазрушающих и используемых в фармацевтических целях; будут изучаться механизмы старения грибной клетки с использованием модельных аско- и базидиальных грибов; создана коллекция грибов-экстремофиллов и штаммов перспективных для биотехнологии
-
Abstract:
In the framework of the theme the physiological, biochemical, cytological and genetic characteristics of fungi of various ecologo-trophic groups that will be explored. New data of the composition and functional mechanisms of adaptation of fungi to extreme habitats wiil be obtained. The new information about the genetics and metabolic capabilities of fungi including of wood-destroying species and fungi used in pharmaceutical purposes will be discovered. The aging mechanisms of fungal cells using as model ascomycetes and basidiomycetes species will be examined and the collection of fungi-extremophiles and strains perspective for biotechnology will be created.
-
Планируемые результаты:
Будут получены данные о грибных сообществах в различных компонентах наземных и водных экосистем, включая экстремальные местообитания. Изучены изменения в составе цитозоля и мембран, особенностях жизненного цикла, ультраструкты клеток и органелл (митохондрий), физиологии, внеклеточного ферментного комплекса и генома грибов разных эколого-трофических групп и при различных воздействиях. Это позволит глубже понять механизмы приспособления грибов к экстремальным местообитаниям, взаимодействий с другими организмами; новые сведения о генетике и метаболических возможностях грибов в том числе дереворазрушающих будут актуальными для разработки препаратов для биотехнологии и медицины. Определены перспективные маркеры для изучения старения грибной клетки, получены новые данные о феномене длительного существования грибов в растущем состоянии и старении грибов. Создана коллекция грибов-экстремофилов и штаммов перспективных для биотехнологии и фитопатологии, разработаны современные новые приемы идентификации и мониторинга грибов, важных для устойчивого развития растениеводства.
-
Научный задел:
Коллектив обладает оригинальными подходами, подобранными средами и схемами выделения грибов, включая экстремофильные, сапротрофные и фитопатогенные виды, из различных компонентов экосистем. Освоены и разработаны собственные приемы для идентификации грибов, включая молекулярно-генетические, накоплен большой опыт проведения скрининга активных продуцентов ферментов и антибиотиков. Отработана схема выяснения биохимических реакций (по изменению состава цитозоля и липидов мембран, ферментативной активности, спектра ферментов) и ряда других характеристик грибов на воздействие экстремальных значений рН, концентрации соли и других факторов среды. Есть и постоянно расширяется уникальная коллекции штаммов грибов, включающая представителей разных эколого-физиологических групп и новых видов (открытых сотрудниками кафедры) алкалофильных и алкалотолерантных грибов. Данные таксоны пока отсутствуют в мировых коллекциях и исследование физиолого-биохимических свойств, выявление у них метаболитов, важных для биотехнологий имеет приоритетное значение. Получены важные данные о составе грибных сообществ в наземных экосистемах и экофизиологии грибов разных таксономических групп, продукции ими протеаз, антибиотических соединений. Это позволяет проводить в дальнейшем сравнительные исследования с микобиотой водных экосистем, прибрежных зон, глубже понять особенности состава грибов в разных экотопах и успешнее вести поиск нужных продуцентов для биотехнологий и медицины.
-
Основные результаты:
Исследование микобиоты в наземных и водных экосистемах, с акцентом на экстремальные экотопы. Их цель – изучение таксономического разнообразия и взаимодействий грибов с другими организмами, их экофизиологии, биохимических и морфологических механизмов адаптации, жизненные циклов, участия в деструкции органических веществ и синтезе биологически активных соединений, генетических и ультаструктурных особенностей, механизмов старения и выхода на возможности практического применения представителей грибного царста. 1. Алкалофильные и алкалотолерантные грибы из разных регионов мира 1.1 Биоразнообразие и филогения. Исследованы грибы в уникальных природных местообитаниях - засоленных и щелочных почвах (содовых солончаках) России (побережья озер в степях Западной и Южной Сибири), Монголии, Кении (оз. Магади), Казахстане, Армении. Более 150 образцов почв содово-сульфатного, содово-хлоридного, содово-сульфатно-хлоридного и содового засолений со значениями рН 7.1 - 11.5, и суммой растворимых солей от 0.2 до 385.0 г/кг было проанализировано с использованием селективной щелочной среды. Также изучены нейтральные окультуренные почвы Москвы и Подмосковья, побережья (песчаные грунты) морей (Белого, Балтийского, Баренцева, Японского), образцы прибрежной зоны Шпицбергена, гиперсоленые нейтральные почвы побережья оз. Баскунчак (Астраханская обл.), оз. Эльтон и Булухта (Волгоградская обл.), почвы побережья некоторых засоленных озер Забайкалья. Общее число исследованных образцов превышало 400. Филогенетический анализ, проведенный на основе секвенирования участков ITS, LSU рДНК, SSU рДНК, TEF-1alpha, b-tubulin, RPB2, показал полифилетичность группы алкалофильных/толерантных грибов. Устойчивость к щелочным условиям эволюционно неоднократно возникала у разных групп аскомицетовых грибов. Щелочеустойчивые грибы представлены среди аскомицетов, преимущественно в сем. Plectosphaerellaceae, Chaetomiaceae, Myrotheciomycetaceae и Pleosporaceae. 1.2 Новые таксоны. Описаны, проиллюстрированы и опубликованы новые для науки таксоны аскомицетов: 2 рода Sodiomyces, Chordomyces; новая секция – Alternaria sect. Soda; 8 новых видов - Sodiomyces alkalinus, S. magadiensis, S. tronii; Emericellopsis alkalina, Chordomyces antarcticus, Alternaria kulundii, A. petuchovskii, A.shukurtuzii. 1.3. Особенности экофизиологии: отношение к фактору рН, концентрации хлористого натрия, температуре. В щелочных почвах присутствуют грибы с разными типами адаптации к фактору рН. Анализ кривых роста грибов в диапазоне значений рН от 4 до 11 позволил выделить группы алкалофилов (облигатных и факультативных) и алкалотолерантов (сильных, умеренных и слабых). Предложена схема определения типа адаптации к фактору рН. Обнаружено и доказано явление алкалофилии у грибов. Обнаружен и подтвержден облигатно алкалофильный тип адаптации у видов рода Sodiomyces – S. alkalinus, S. magadiensis и S. tronii. Оптимальными для роста были значения рН выше 8. По характеру кривых зависимости скорости роста алкалофильных грибов от концентраций NaCl в среде их можно отнести к галотолерантам. Галофильных грибов, требующих для роста определенных концентраций солей, нами найдено не было. Отношение к температуре отличалось у изолятов грибов разных регионов. Особенно наглядно это было показано для Sodiomyces spp. Наиболее жарким из всех исследованных местообитаний было побережье оз. Магади. Оптимум роста у S. tronii и S. magadiensis, изолированных с побережья озера, отмечен при 32 °C, для всех изолятов S. alkalinus (изоляты с побережий озер Западной Сибири, Забайкалья, Монголии, Танзании) оптимальной была температура около 28°C. 1.4. Особенности жизненных циклов и морфологии. Описан Sodiomyces – тип развития половой стадии, свидетельствующий о приспособлении к обитанию на побережье содовых озер и имеющий конвергентное сходство с клейстотециальными морскими грибами и с обитателями затапливаемых субстратов. Показано сходство морфологических признаков исследованных алкалофильных и алкалотолерантных грибов для представителей Plectosphaerellaceae и Myrotheciomycetaceae характерно acremonium-, verticillium-, gliocladium–подобное конидиальное спороношение, с обильным образованием слизи при бесполом и половом спороношении, с агрегацией мицелия в тяжи, склеенные слизью, плодовые тела замкнутые. Для Pleosporaceae наличие хламидоспор или микросклероциев, которые могут прорастать конидиями. 1.5. Механизмы адаптации щелочеустойчивых грибов к фактору рН: исследование динамики углеводов цитозоля, мембранных и запасных липидов у алкалофильных и алкалотолерантных грибов в ответ на изменение внешнего рН. Впервые показано, что ответ на изменение внешнего рН у алкалофильных и алкалотолерантных грибов различается. У алкалофилов большую роль играет трегалоза, высокий уровень которой наблюдается на всех стадиях роста при различных рН, в щелочных условиях характерна аккумуляция маннита и арабита. У алкалотолерантов ответ на изменение pH происходит только за счет изменения соотношения арабита и маннита, при этом маннит доминирует в нейтральных и кислых условиях, а арабит – в щелочных. В трофофазе у алкалофильного гриба S. tronii, в составе мембранных липидов доминируют небислойные фосфолипиды - фосфатидные кислоты, а в ответ на снижение рН среды существенно возрастает доля стеринов и сфинголипидов, что указывает на образование рафтов. 1.6. Распространение и экология. Щелочеустойчивые грибы обнаружены нами практически во всех исследованных регионах. Факультативные алкалофилы и алкалотолеранты распространены достаточно широко и входят в разные эколого-трофические группы. Облигатные алкалофилы колонизирует специфические ниши. Они имеют локальное распространение и приурочены к местам сильного содового засоления. Реконструкция эволюции ферментов показала, что растительные остатки, представляющие основной субстрат для большинства видов грибов, не являются предпочтительными для S. alkalinus. Грибы морских грунтов: физиология и таксономия. Проведен комплексный анализ микобиоты арктических морей России – Белого, Лаптевых, Восточно-Сибирского и Карского, от глубин 5-10 м до 200 м и более. Подтверждено присутствие грибов во всех изученных морских субстратах – как в пелагиали в качестве ассоциантов с фитопланктоном, так и в донных осадках в виде активно развивающегося мицелия, в том числе в области метановых сипов и на глубинах до 3000 м. Детальное изучение проведено видового состава микроскопических грибов Белого моря. - от литорали до глубоководных грунтов. Выявлены виды, активно функционирующие в грунтах, на органических субстратах (крахмале, целлюлозе, хитине, кусочках таллома ламинарии), они растут на средах с морской водой, при низких температурах и при разном уровне обеспеченности кислородом. В эту группу входят Paradendryphiella salina, Acremonium tubakii, A. potronii, Pseudeurotium hygrophilum, Pseudogymnoascus pannorum, Emericellopsis sphaerospora, Oidiodendron periconioides, Parengyodontium album, Lecanicillium muscarium, виды Tolypocladium и Sarocladium. 3.Грибы в донных грунтах озера Байкал. Проведен отбор проб донных грунтов озера Байкал и получены первые детальные данные о видовом разнообразии микобиоты этих экотопов и пуле грибной биомассы. Изоляты были идентифицированы по культурально-морфологическим и генетическим признакам. Дан анализ распространения видов по глубинам. Разнообразие грибов, выделенных из озера Байкал, превышает 80 видов. 4.Грибы в торфяниках болот северных регионов. Исследована структура комплексов, проведен таксономический анализ по морфолого-культуральным и генетическим признакам грибов в заболачивающихся прибеломорских водоемах, в торфяниках мерзлотных залежей Кольского п-ва и Республики Коми, подзона крайней северной тайги. Проведены эксперименты по изучению физиологии аcremonium-подобных видов. 5. В рамках программы экспериментов проведена работа по изучению влияния условий открытого космоса на жизнеспособность микромицетов (на космическом аппарате (КА) Фотон-4 М на 20 видах грибов из 14 родов, выделенных из строительных материалов на минеральной основе и агенты биоповреждений промышленных материалов). 6. Взаимодействие и состав микроводорослей и бактерий в плодовых телах ксилотрофных грибов. Исследование плодовых тел нескольких видов ксилотрофных базидиальных грибов показало высокое разнообразие водорослей (зеленые, эвгленовые и сине-зеленые), а также бактерий в тканях плодового тела. В них обнаружены не только фотосинтезирующие про- и эукариотические организмы, но и бактерии. Основные взаимодействующие партнеры (зеленые водоросли, цианобактерии и гифы грибов) способны к образованию обильных слизистых чехлов, предохраняющих клетки от высыхания и создающих питательную среду обитания для гетеротрофных организмов. 7.Азотное питание и дыхание грибов. На ксилотрофном и гумусовом сапротрофе впервые проведено сравнительное исследование функциональной роли основного и альтернативного дыхания в условиях голодания по азоту. Продемонстрировано преимущественное функционирование альтернативной дыхательной цепи (альтернативной цитохромоксидазы) у ксилотрофного гриба Stereum hirsutum в сравнении с гумусовым сапротрофом Coprinus comatus, у которого активно функционируют два пути транспорта электронов. Разработана тест-система, включающая две митохондриальные флуоресцентные пробы и протонный разобщитель, позволяющая эффективно метить митохондрии на флуоресцентно-микроскопическом уровне и анализировать их поляризованность, что впервые приблизило качественный уровень исследований митохондрий грибов к уровню работы с животными клетками. С помощью этой тест-системы подтверждено наличие у ксилотрофных базидиомицетов сверхдлинных (длиной до 100 мкм и более), нитевидно-сосудовидных разветвленных митохондрий, тянущихся вдоль гиф. Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных базидиомицетов являются приспособлением к существованию данных грибов на лигно-целлюлозном субстрате, с крайне низким содержанием азота. На основе лабораторных опытов предложена модель псевдопоискового роста древоразрушающих грибов в условиях дефицита азота. 8. Механизмы старения грибов. Разработана методика иммунного дот-блотинга, что позволило установить особенности влияния оксидативных агентов на накопление карбонилированных белков (маркеров старения) в грибном мицелии. Считается, что при воздействии оксидативных агентов на живые организмы содержание маркеров гипероксидации должны быть выше. Однако для грибов, что при определенных условиях картина может быть прямо противоположной. Грибы очищают свои клетки от маркерных молекул в ответ на оксидативное воздействие. 9. Впервые продемонстрировано существование нескольких путей эндоцитоза у мицелиальных базидиомицетных грибов: микропиноцитоза (размер везикул до 20 нм) и макропиноцитоза (размер поглощенных везикул от 20-200 нм). Классический микропиноцитозный путь включает инвагинацию плазматической мембраны, формирование везикул, ранних и поздних эндосом, и деградацию поглощенного «груза» в вакуолях, либо возврат (рециклинг) компонентов плазмалеммы. Начальные этапы этого пути на структурном уровне можно наблюдать с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Эндоцитоз может идти по макропиноцитозному пути, когда происходит захват более крупных полимерных молекул, которые могут транспортироваться в эндосомах к вакуолям грибной клетки, где происходит их гидролиз до мономеров. Присутствие макропиноцитозного пути поглощения у грибов изменило в корне наши представления об исключительно внеклеточном пищеварении у грибов. 10.Впервые изучена ультраструктура биолюминесцентных видов грибов в динамике свечения (минимум и максимум) методом трансмиссионной электронной микроскопии. Сравнение с небиолюминесцентными родственными видами грибов показало, что доля клеток, содержащих мембранные структуры, напоминающие миелиноподобные тела в клетках животных, увеличивается на 13-35 % для светящихся грибов и уменьшается на 6-30 % для небиолюминесцентных видов, что может свидетельствовать о локализации биолюминесцентной ферментной системы в этих мембранах. 11. Эволюционный эксперимент длительному непрерывному культивированию Podospora anserina. Это аскомицетный гриб, проявляющий выраженное фенотипическое старение при росте на твердой среде, но обладающий неограниченной продолжительностью жизни в условиях погруженного культивирования (к настоящему времени 8,5 лет).. В течение первых 4 лет эксперимента 125 однонуклеотидных замен и 23 коротких зафиксировались в геномах восьми независимо эволюционирующих популяций. Шесть белков, которые влияют на рост и развитие гриба, подверглись эволюции более, чем в одной популяции. Данная тенденция проявилась в случае альфа-субъединицы G-белка FadA – новые аллели соответствующего гена закрепились в семи из восьми экспериментальных популяций. Эти замены затронули четыре аминокислотных остатка, что является беспрецедентно высоким уровнем параллелизма, который когда-либо был выявлен в условиях экспериментальной эволюции. Параллельная эволюция на уровне генов и метаболических путей, избыток нонсенс- и миссенс-мутаций, а также повешенная консервативность белков и их сайтов, в которых произошли изменения, позволяют предположить, что многие из обнаруженных замен адаптивны и обусловлены положительным отбором. 12.Коллекции грибов. Создана коллекция грибов из экстремальных местообитаний, которая включает 353 штамма, из которых 150 хранится в условиях криоконсервациии и полностью каталогизированы.Значительно (на 75 штаммов) расширена коллекция культивируемых базидиомицетов, перспективных для использования в пищевых и медицинских целях. Для криоконсервации при первичной закладке нового штамма концентрация глицерина должна быть 5 и 30%, что позволит минимизировать риск потери штамма. Затем, в случае длительного хранения штамма, необходим подбор оптимальной концентрации глицерина. 13. Поиск новых продуцентов и метаболитов грибов. Обнаружен и охарактеризован новый пептаибол, названный эмерициллипсином А, синтезируемый алкалофильным изолятом Emericellopsis alkalina. Эмерициллиписин А - линейный пептид, образует альфа-спираль и содержит 9 аминокислотных остатков. Он является новым антимикробным пептидом, проявляющим активность по отношению к плесневым и дрожжевым грибам. У морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) впервые установлена продукция циклоспоринов. Отобраны штаммы Sodiomyces alkalinus и Chordomyces antarcticum, способные продуцировать внеклеточные алкалостабильные протеазы, активные не только в щелочных условиях (рН 10-11), но и 30%-ном содержании хлорида натрия, воздействии ионного (SDS) или неионного (Triton-100) детергентов, добавке в реакционную среду перекиси водорода, коммерческого детергента Ariel и жидкого пятновыводителя Vanish Oxi Action, что указывает на их перспективность для практического применения. Изучены особенности циклов развития и формирования базидиом у 8-х видов базидиальных макромицетов, перспективных в пищевых и медицинских целях.
- Добавил в систему: Ратанина Мария Александровна
Источник финансирования НИР
| госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий |
| Результаты этапа: Проведены выделение и идентификация галоалкалотолерантных видов грибов из засоленных почв, и исследования по выявлению бактериальных ассоциантов алкалофильных микромицетов. Определены закономерности изменения состава липидов мембран и углеводов цитозоля у строгих алкалофилов рода Sodiomyces к снижению кислотности среды и их значение в адаптации к этому стрессу. У отобранных ранее активных штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов оценена алкалостабильность внеклеточных протеаз и их активность при различных температурах. Получены сведения о микобиоте глубоководных илов Белого моря и исследована антибиотическая активность грибных штаммов из этого местообитания, отобрано 5 активных штаммов. Изучены трофические предпочтения штаммов Qaumbalaria cyanescens, изолированных с мужских сережек пыльцы березы, и влияние источников азота и углерода в среде на рост и жизненный цикл гриба (переход к дрожжевой стадии). Цитологическое изучение ассоциации грибов Trichaptum fusco-violaceum, T. pargamenum, Stereum hirsutum и Cerrena unicolor и водорослей выявило локализацию фототрофных про- и эукариотных микроорганизмов и гетеротрофных бактерий на поверхности ив их плодовых телах, получены данные о характере их взаимоотношений. Исследованы механизмы, обеспечивающие поддержание жизнеспособности трутовика S. hirsutum на среде без внесения азотсодержащих соединений. Охарактеризована зависимость биологического возраста мицелия Podospora anserina от стадии роста колонии, температуры хранения. Проверена гипотеза о стабильности биологического возраста P. anserina вплоть до гибели мицелия в последнем пассаже. Отработана методика по исследованию ультраструктуры P. anserina. Получены данные о необратимой изменчивости аскомицетного гриба P. anserina (Rabenh.) Niessl при непрерывном поддержании роста мицелия на жидкой питательной среде. Установлено, что физиологически измененных линий P. anserina не формируют плодовых тел даже после прохождению жизненного цикла в условиях, приближенным к естественным. | ||
| 2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий |
| Результаты этапа: Описаны изменения биоты грибов в фитоценозах вторичной сукцессии при зарастании сельхозугодий в южной тайги. Изучен состав грибов в гиперсоленых почвах с хлоридным типом засоления и исследован их характер адаптации к рН, температуре и хлористому натрию. Определено изменение состава липидов мембран и растворимых углеводов цитозоля у штаммов алкалотолерантных видов при повышении рН в среде. Оценена стабильность и активность протеаз в щелочных условиях и повышенном содержании хлорида натрия у алкалофилов и алкалотолерантов. У микромицетов из морских илов определена скорость роста на различных источниках углерода, при гипоксии, пониженных температурах и разной концентрации хлорида. Отобраны новые изоляты с антигрибной активностью и штаммы базидиомицетов с высокой антиоксидантной активностью. Методом иммунного дот-блоттинга и иммуно-выявляемых маркеров старения и оксидативного стресса получены новые данные по изменению биологического возраста грибов Stereum hirsutum, Podospora anserina и Cordiceps militaris при их росте на твердых средах. Для Podospora anserina впервые установлено распределения поврежденных белков в прорастающих аскоспорах, отработан метод выявления митохондрий и определены особенности их распределения в мицелии Stereum hirsutum и Coprinus comatus, методы хранения базидиомицетов при низких температурах. получены сведения о функционировании дыхательных электрон-транспортных цепей у базидиомицетов при среде Чапека и при дефиците азота или углерода. | ||
| 3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий |
| Результаты этапа: Продолжено исследование соле- и щелочеустойчивых грибов в прибрежной зоне содовых озер, литорали и донных грунтов морей Северного Ледовитого и Атлантического океанов. Проведено выделение таких грибов из собранных образцов и коллекция пополнена на 200 культур, около половины из которых идентифицировано с использованием морфолого-культуральных и генетических признаков. Исследованы in vivo культуры грибов в ассоциациях с другими организмами (бактериями). Для Sodiomyces alkalinus показана тесная связь с бактериями и, по-видимому, он использует в качестве источников питания бактерии и ракообразных, что согласуется с местами его обнаружений, которые близки к воде и полностью лишены растительности. Описан новый Sodiomyces-тип развития плодовых тел, который имеет конвергентное сходство с морскими грибами. Изучена динамика растворимых углеводов цитозоля и мембранных липидов у факультативно алкалофильных грибов Emericella alkalina и Sodiomyces tronii в ответ на изменение pH среды и тепловой шок, соответственно. Обнаружен низкий уровень трегалозы в цитозоле E. alkalina, основными сахарами являются маннит и арабит. В кислых условиях преобладает маннит, в высокощелочных – арабит. Значимых изменений в составе мембранных липидов в при разных значений pH среды у E. alkalina не наблюдали. В контрольных условиях состав углеводов у Sodiomyces tronii представлен трегалозой (48-56% от суммы сахаров), а также глюкозой и маннитом. При тепловом шоке, ингибируется синтез маннита; содержание трегалозы и глюкозы остается на высоком уровне, значительных изменений в липидном составе мембран не обнаружено. Изучена способность 22 штаммов Emericellopsis alkalina из коллекции грибов экстремальных местообитаний к синтезу новых противогрибных пептаиболов (А118-37 и его гомологов). Для нового пептаибола А118-37, названного эмерициллипсином А, выяснена молекулярная формула и охарактеризована структура. Эмерициллиписин А - линейный пептид, образует альфа-спираль, молекулярная формула C54H99N9O11 с изотопной молекулярной массой 1049.746. Получены данные о противогрибковой активности эмерициллиписина А в отношении клинических штаммов. Внеклеточные алкалостабильные протеазы у 4-х штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов (Sodiomyces alkalinus F10, Gibellulopsis nigrescens MAG21, Chordomyces. antarcticum M27 и V213) сохраняют высокие активности не только при 30%-ном содержании хлорида натрия в среде, но и устойчивы к воздействию ионного (SDS) и неионного (Triton-100) детергентов, что важно для их практического применения. Продолжено изучение микроскопических грибов, изолируемых из морских грунтов Белого моря и других морей. Выделено 70 видов, которые относились к 26 родам, 18 семействам, 10 порядкам, 8 классам и 3 отделам. Установлены грибы, способные развиваться в условиях низких температур, лимитации по кислороду и на различных органических субстратах (крахмал, целлюлоза, хитин, таллом ламинарии) в донных грунтах in vitro. Физиологическая характеристика изолятов этих видов показала, что все они галотолерантные, многие с оптимумами роста на среде с содержанием хлорида натрия как в морской воде, большинство из них психротолерантные, многие факультативные анаэробы, и все могут разлагать субстраты, поступающие в морские грунты. Высокая антимикотическая активность обнаружена у морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) при росте, как на твердых, так и жидких средах, и связана она, по предварительным данным, с активным синтезом циклоспоринов. Установлен состав грибов (Acremonium spp., Oidiodendron spp., Bionectria sp. (anam. Clonostachys sp.), Pleosporales, Alternaria alternate, Trichoderma spp., Mucor sp.), развивающихся и, видимо, мацерирующих Sphagnum fallax, доминирующем на болотах в подзоне крайней северной тайги (Республика Коми). Проведен сбор более 80 плодовых тел макромицетов и выделение из них чистых культур, их идентификация и депонирование в GenBank ITS-последовательностей (14 штаммов трутовых грибов). Филогенетический анализ штаммов коллекции из рода Ganoderma и вида Fomitopsis pinicola на основе ITS- последовательностей кластера генов рРНК показал высокий уровень генетического полиморфизма для штаммов Ganoderma и относительный консерватизм ITS локуса у трутовика окаймленного F. pinicola. на территории Европейской части России, Финляндии и Франции. Продемонстрирована возможность использования минисателлитных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации штаммов F. pinicola. Охарактеризованы группы вегетативной несовместимости для природных штаммов трутовика окаймлённого. Наибольшую противоопухолевую активность проявили метанольные экстракты трех видов – F. pinicola, I. obliquus и T. versicolor – с эффективной концентрацией препарата не менее 50 мкг/мл. Тесты на цитотоксичность показали перспективность экстрактов грибов Fomitopsis pinicola (штамм Fp-7) и Trametes versicolor (штамм It-1) как противоопухолевых агентов. Изучены особенности циклов развития и формирования базидиом 4-х видов базидиальных макромицетов из разных эколого-трофических групп: гумусовых сапротрофов – шампиньоны двуспоровый и двукольцевой Agaricus bisporus и A. bitorquis, ксилотрофов – вешенка устричная Pleurotus ostreatus и зимний опенок Flammulina velutipes. Проверены на жизнеспособность мицелиальных культуры базидиомицетов, штаммы которых заложены на хранение в 2015 году. Требуется дальнейшая оптимизация условий длительного хранения макромицетов, в первую очередь, учет влияния криопротекторов на их морфолого-культуральные характеристики, для чего заложен новый долгосрочный эксперимент с разными концентрациями криопротектора (глицерина). Методами флуоресцентной и электронной микроскопии исследован эндоцитоз у фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani. Данные, полученные микроскопическими методами, позволяют предположить существование его нескольких путей: микропиноцитоз (размер везикул до 20 нм) и макропиноцитоз (размер поглощенных везикул от 20-200 нм). Классический микропиноцитозный путь включает инвагинацию плазматической мембраны, формирование везикул, ранних и поздних эндосом, и деградацию поглощенного «груза» в вакуолях, либо возврат (рециклинг) компонентов плазмалеммы. Начальные этапы этого пути на структурном уровне можно наблюдать с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Эндоцитоз может идти по макропиноцитозному пути, когда происходит захват более крупных полимерных молекул, которые могут транспортироваться в эндосомах к вакуолям грибной клетки, где происходит их гидролиз до мономеров. Продолжается длительный, к настоящему времени 6,5-летний эксперимент по поддержанию гриба Podospora anserine в активном растущем состоянии. Независимые линии культуры, полученные в таких условиях, показали себя как морфологически стабильные, быстро набирающие биомассу, сохраняющие способность метаболизировать широкий круг субстратов, включая сложные (казеин), не требующие специфических условий для своего роста, устойчивые к стрессу (добавление NaCl). Были сделан ряд дополнительных наблюдений за формированием, благодаря инвагинации цитоплазматической мембраны, двумембранных везикул P. anserina. Оказалось, что двумембранные везикулы не являются специфичными для экспериментальных линий, а присутствуют и у контрольных штаммов P. anserina, из которых наши линии были получены. Однако в клетках контрольных штаммов везикулы с двумя мембранами встречаются реже, и их сложнее заметить из-за более высокой электронной плотности цитоплазмы и обилия мелких одномембранных вакуолей. В работе по подбору эффективных маркеров грибного старения начаты исследования возможности применения антител к HNE - продукту пероксилипидной модификации белков. Были также обнаружены и устранены серьезные технические ошибки в используемом ранее иммунологическом методе полуколичественного анализа других маркеров грибного старения (карбонилированных белков). | ||
| 4 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий |
| Результаты этапа: Работы по теме «Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий» имеют фундаментальное и прикладное значение. Продолжено исследование микобиоты в наземных и водных экосистемах, с акцентом на экстремальные экотопы, с целью характеризовать таксономию, экофизиологию, биохимические механизмы адаптации, жизненные циклы, связи с грибов другими организмами, участие в деструкции органических веществ и синтезе биологически активных соединений. Впервые изучали состав щелочеустойчивых грибов в экотопах нейтрального засоления (побережье хлоридного озера Баскунчак). Идентифицированы 55 культур микромицетов по морфолого-культуральным признакам, 40 культур с применением молекулярно-генетических методов, проведен филогенетический анализ и исследован характер адаптации к факторам pH, солености у представителей разных таксонов. Выполнен микологический анализ образцов песчаного грунта литорали Балтийского, Баренцева и Белого морей. Грибы выделены в чистую культуру, получены моноспоровые изоляты. Разнообразие грибов в песчаных грунтах исследованных морей не высоко. Общей особенностью является большая доля темноокрашенных грибов, и в разных морях доминируют различные виды. Изучен состав грибов, ассоциированных с красной водорослью Palmaria palmata, произрастающей в Кандалакшском заливе Белого моря. Всего выделен 461 изолят – 403 мицелиальных и 58 дрожжевых грибов. Обнаружены облигатно-морские виды: Acremonium fuci, Cladosporium salinae, Paradendryphiella arenaria и P. salina. Начат комплексный анализ микобиоты арктических морей России - Лаптевых, Восточно-Сибирского и Карского. Проведены посевы образцов на питательные среды на основе морской воды и микроскопические наблюдения грибов с помощью окрашивания люминесцентными красителями Calcofluor White, DAPI. Визуально подтверждено присутствие грибов во всех изученных морских субстратах – как в пелагиали в качестве ассоциантов с фитопланктоном, так и в донных осадках в виде активно развивающегося мицелия, в том числе в области метановых сипов и на глубинах до 3000 м. Продолжено выявление особенностей физиологии щелочеустойчивых изолятов коллекции для выяснения типа адаптации к фактору рН, солености, температуре для выяснения типа адаптации к этим факторам. Такие данные получены как для изолятов с побережья соленых озер, так и для изолятов, колонизирующих штукатурку и камень, которые продемонстрировали алкалотолерантный и алкалофильный тип адаптации. Проведено исследование динамики растворимых углеводов цитозоля и мембранных липидов у факультативно алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina в ответ на изменение концентрации хлористого натрия в среде. Показана ключевая роль осмолитной системы в процессе адаптации гриба к осмотическому фактору путем накопления эритрита, тогда как участие мембранных липидов в этом процессе невелико. Исследован спектр антимикробной активности нового липопептида – эмерициллипсина А, выделенного из алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina. Зарегистрирована способность эмерициллипсина А подавлять рост патогенных грибов – возбудителей тяжелых и хронических микозов. Подобраны условия биосинтеза и состав питательной среды, обеспечившие более высокий уровень накопления пептида в среде. Все изоляты E. alkalina, в отличие от других исследованных видов рода Emericellopsis, способны к синтезу эмерициллипсина А. Выход продукта значительно варьирует в зависимости от изолята E. alkalina, некоторые изоляты Emericellopsis способны к продукции гомологов и/или других пептаиболоподобных компонентов. Внеклеточные протеазы 2-х штаммов алкалофильных и алкалотолерантных грибов (Sodiomyces alkalinus F10 и Chordomyces antarcticum M27) сохраняют высокий уровень активности не только при 30%-ном содержании хлорида натрия и рН среды 9-10, и устойчивы к воздействию ионного (SDS) и неионного (Triton-100) детергентов, но и при введении в среду окисляющего соединения (перекиси водорода), коммерческого детергента Ariel или жидкого пятновыводителя Vanish Oxi Action. Это свидетельствует о хороших потенциальных возможностях практического применения внеклеточных протеаз этих грибов. Продолжено изучение состава и метаболической активности микроскопических грибов, изолируемых из морских грунтов морей Северного Ледовитого океана. Получены первые данные о пуле грибной биомассы в донных грунтах северных морей (Карского моря). Микроскопические грибы - представители рода Tolypocladium, характерные для морских донных грунтов, способны с высокой активностью к анаэробному восстановлению нитратов с образованием закиси азота, и это показано впервые. Существенно ниже скорость выделения закиси азота в анаэробных условиях продемонстрировали морские штаммы видов Trichoderma polysporum, T. harzianum, Emericellopsis sphaerospora, Penicillium solitum Westling, Penicillium montanense, остальные из протестированных 18 штаммов разных видов (Umbelopsis vinacea, Lecanicillium lecanii и ряд других) не образовывали закись азота. Обнаружение довольно высокой активности выделения закиси азота грибами в условиях лимитации снабжения кислородом указывает на необходимость оценки этого процесса непосредственно в донных грунтах, также при использовании грибами нитритов в качестве акцепторов электронов. Подтверждена высокая антимикотическая активность у морских изолятов рода Tolypocladium (T. cylindrosporum, T. inflatum) при росте, как на твердых, так и жидких средах, и установлено, что связана она с активным синтезом циклоспоринов. Продукция циклоспоринов морскими штаммами вида T. inflatum установлена впервые. Проведены сборы более 70 плодовых тел макромицетов из разных регионов европейской части России, выделение их в чистые культуры и идентификация. Подтвержден видовой статус 38 штаммов гомобазидиальных грибов, отобранных для последующей оценки эффективности утилизации органических субстратов - отходов производств. Подобраны праймеры для молекулярно-филогенетического анализа родов Ganoderma и Pleurotus. Филогенетический анализ штаммов коллекции из рода Ganoderma и вида Fomitopsis rosea на основе ITS- последовательностей кластера генов рРНК показал, что виды рода Ganoderma характеризуются высоким генотипическим разнообразием, и природные штаммы коллекции четко разделяются на клады согласно их видовой принадлежности. Изучены особенности роста и морфогенеза при культивировании Agaricus bisporus штамм Sylvan A15 в случае внесения в компост добавок белкового и углеводного питания на основе отходов сельского хозяйства. Установлено пролонгированное действие подобранных композитных добавок на плодоношение шампиньона, которое выражалось в увеличении массы плодовых тел или их численности, в отдельных случаях урожайности гриба. Продолжен долгосрочный эксперимент по хранению чистых культур макромицетов при разных концентрациях криопротектора (глицерина). Установлено, что при первичной закладке нового штамма концентрации глицерина должны быть 5 и 30%. Это позволит минимизировать риск потери штамма. Для длительного хранения штамма необходим подбор оптимальной концентрации глицерина. Разработана тест-система, включающая две митохондриальные флуоресцентные пробы и протонный разобщитель, позволяющая у мицелиальных базидиомицетов эффективно метить митохондрии и определять их поляризованность. Это впервые приблизило уровень исследований грибных митохондрий грибов к таковому с митохондриями в клетках животных. С помощью этой тест-системы подтверждено наличие у ксилотрофных базидиомицетов сверхдлинных (длиной до 100 мкм и более), нитевидно-сосудовидных разветвленных митохондрий, тянущихся вдоль гиф. Сверхдлинные митохондрии присутствуют только в мицелии ксилотрофных грибов, и их количество лишь в малой степени зависит от питательной ценности субстрата. Они поляризованы, хотя не так сильно, как палочковидные митохондрии у нексилотрофного вида Coprinus comatus. Молодые сверхдлинные митохондрии несут кристы, но при созревании теряют последние и могут превращаться в длинные полые двух-мембранные трубки. Предположено, что сверхдлинные митохондрии ксилотрофов несут переменную функцию: сначала дыхательную, затем - тубулярно-транспортную, участвуют в перемещении внутриклеточных ресурсов на дальние расстояния. Сверхдлинные митохондрии вкупе с другими приспособлениями позволяют дереворазрушающим грибам успешно колонизировать и использовать древесный субстрат, недоступный для большинства других микроорганизмов. Продолжается длительный, к настоящему времени 7,5-летний эксперимент по поддержанию гриба Podospora anserine в активном растущем состоянии. В геномах культивируемых экспериментальных линий Podospora anserina в 2019 году были обнаружены новые мутации. Их распределение оказалось крайне неравномерным: в двух из восьми линий добавилось по 2 новые мутации, в то время как в одной из линий было найдено 60, что может быть эффектом появления гена-мутатора. Выявлено обогащение несинонимическими мутациями, заменяющими аминокислоту в соответствующем белке. В работе по подбору маркеров грибного старения после доработки методики иммунного дот-блотинга, были установлены особенности влияния оксидативных агентов на накопление карбонилированных белков в грибном мицелии. Если при воздействии оксидативных агентов на живые организмы считается, что маркеры гипероксидации должны быть завышенными. Однако для грибов установлено, что при определенных условиях ситуация может быть прямо противоположной. Грибы очищают свои клетки от маркерных молекул в ответ на оксидативное воздействие. | ||
| 5 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Экофизиология, цитология и генетика грибов как основа рационального природопользования и биотехнологий |
| Результаты этапа: Продолжено исследование микобиоты в наземных и водных экосистемах, с акцентом на экстремальные экотопы. Их цель – изучение таксономического разнообразия и взаимодействий грибов с другими организмами, их экофизиологии, биохимических и морфологических механизмов адаптации, жизненные циклов, участия в деструкции органических веществ и синтезе биологически активных соединений. В 2020 году была значительно расширена коллекция грибов из экстремальных местообитаний за счет анализа новых субстратов из следующих регионов России (Астраханская обл., Алтайский край, Курганская обл., Мурманская обл., Иркутская обл., Бурятия), прибрежных и донных грунтов морей Северного Ледовитого океана. Впервые проведены выделения грибов из грунтов (23 м и 230 м) Восточно-Сибирского моря и их идентификация по культурально-морфологическим и молекулярно-генетическим признакам изолятов. Продолжено исследование щелочеустойчивых грибов в условиях нейтрального засоления на примере хлоридного озера Баскунчак. Проведен анализ культур по типу адаптации к разным факторам среды, выявлены галофильные и алкалофильные изоляты. Для штамма рода Scopulariopsis установлена облигатная галофильность и способность расти при 3.5 M NaCl в среде. Облигатно алкалофильные изоляты из рода Sodiomyces предположительно являются новыми видами. Подведены итоги исследования изменений содержания растворимых углеводов цитозоля и состава мембранных липидов у факультативно алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina в ответ на модификацию рН и концентрацию хлористого натрия в среде. Установлено, что состав осмолитов цитозоля принципиально меняется под влиянием этих факторов, что позволяет полагать об их роли в адаптации грибов к таким воздействиям. Исследована динамика растворимых углеводов цитозоля и состав мембранных липидов у ксерогалофильного гриба Aspergillus penicillioides в ответ на изменение активности воды и рН. Показано повышение содержания глицерина в мицелии гриба на всех стадиях его роста на средах с 4,0 М глицерином и с 2,0 М NaCl. Продолжено исследование антимикробной активности нового липопептида – эмерициллипсина А, выделенного из алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina. Изучена его активность к биопленкообразующим грамположительным и грамотрицательным клиническим бактериям. Впервые для антибиотика из группы пептаиболов показана способность к ингибированию патогенных бактерий, образующих биопленки. Наиболее эффективно он подавлял грамположительные виды, что определяет специфичность антибактериального действия эмерициллипсина А. Начато выделение чистых культур грибов из донных грунтов озера Байкал и их идентификация по культурально-морфологическим и генетическим признакам. Получены первые данные о видовом разнообразии культивируемых грибов и пуле грибной биомассы в донных грунтах озера Байкал. Создана коллекция чистых культур грибов из озера Байкал, включающая 121 штамм не менее 70 видов. Определена способность штаммов грибов из озера Байкал к продукции антибиотиков. Отобрано около 20 штаммов для оценки спектра их антибиотического действия при культивировании на жидких средах и анализа химической структуры соединений у наиболее активных грибов. Выяснен состав циклоспоринов (A, B, C), которые образуют морские изоляты Tolypocladium inflatum и T. cylindrosporum. Проведен количественный учет, оценка таксономического разнообразия и выявлены доминирующие виды мицелиальных и дрожжевых грибов на разных стадиях трансформации органических отходов в компост и вермикомпост. Оценено влияние внесения отобранного штамма Trichoderma viride на состав микобиоты при компостировании и свойства получаемого биоудобрения. Показано, что инокуляция этого штамма, обладающего ростстимулирующей растения и антигрибной активностями, позволяет получить биоудобрение с дополнительными полезными свойствами и снизить обилие патогенных и фитопатогенных грибов в компостируемых и вермикомпостируемых субстратах. Проведены сборы более 50 плодовых тел макромицетов из разных регионов европейской части России и Мексики, выделение их в чистые культуры и идентификация. Филогенетический анализ на основе ITS последовательностей позволил четко дифференцировать следующие виды Ganoderma – G. applanatum, G. adspersum, G. resinaceum, G. lucidum и G. tornatum; при этом тропические виды G. tornatum и G. weberianum, G. multiplicatum, G. curtisii, G. meredithae на филограмме наиболее удалены от распространённого в средней полосе России вида G. applanatum. Выявлены эндемичные для Центральной Америки виды - G. curtisi, G.meredithae и G. martinicense, а также встречающиеся на всех континентах тропические виды - G. tuberculosum и G. weberianum. Исследованы антиоксидантная и противоопухолевая активности мексиканских штаммов Ganoderma. Антипролиферативный эффект штаммов Ganoderma был показан на пяти линиях опухолевых клеток - A-549, HBL-100, HeLa, T-47D,WiDr. Разработан комплекс лабораторных методов для экспресс-определения относительной эффективности источников белкового и углеводного питания для внесения в компост при выращивании Agaricus bisporus штамма Sylvan A15. Они могут использоваться на предприятиях для определения необходимых питательных добавок, повышающих урожай шампиньонов. Определены трофические предпочтения ранее не изученных видов биолюминесцентных грибов. Аммонийный азот является оптимальным для светящихся представителей семейства Omphalotaceae, а пептон – для представителей рода Panellus, семейства Mycenaceae. Лучшими для роста и свечения мицелия оказались натуральные среды: мальтр-агар и картофельно-глюкозный агар. Охарактеризованы оптимальные условия роста и свечения мицелия биолюминесцентных грибов Panellus luminescens (сем. Mycenaceae) и Omphalotus olearius (семейства Omphalotaceae) на среде мальт-агар. Скорость роста мицелия и свечения исследуемых штаммов на мальт-агаре с буфером максимальны при рН 5 и 6, и температурах - 25 и 27 °С. Впервые изучена ультраструктура биолюминесцентных видов грибов в динамике свечения (минимум и максимум) методом трансмиссионной электронной микроскопии. Сравнение с небиолюминесцентными родственными видами грибов показало, что доля клеток, содержащих миелиноподобные тела, увеличивается на 13-35 % для светящихся грибов и уменьшается на 6-30 % для P. stipticus и утратившего свечение мицелия F. manipularis, что может свидетельствовать о локализации биолюминесцентной ферментной системы в этих мембранах. Установлено, что в определенных случаях грибы очищают свои клетки от маркерных молекул (карбонилированных белков) в ответ на оксидативное воздействие. Такими условиями могут быть стрессы (в частности оксидативные воздействия, перекись водорода), и грибы могут активировать защитные системы, и степень карбонилированности белков снизится. Эксперимент, заключающийся в непрерывном культивировании на жидкой среде модельного гриба Podospora anserina, продолжали в 2020 году (период с 7,5 до 8,5 лет). В пассаже № 532 была достигнута очередная из запланированных временных точек для анализа возможных накопленных мутаций. Для всех 8 экспериментальных линий гриба этого срока выполнено секвенирование полных геномов. Изучение состава липидов у «эволюционирующих» (экспериментальных) линий P. anserina показал, что продолжительный погруженный рост поддерживает мицелий в физиологически молодом состоянии. Не участвующие в эксперименте дикие штаммы, будучи проведенными через несколько пассажей на агаризованной среде, развивают характерный для P. anserina «синдром старения». У экспериментальных линий, исследованных в 4-х точках, различающихся по длительности поддержания гриба в растущем состоянии, относительное содержание основных липидов варьировало незначительно. При этом у них не были обнаружены маркеры, коррелирующие с развитием «синдрома старения». | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".