Молекулярная физиология зрения в норме и при патологииНИР

Molecular physiology of vision in norm and at a pathology

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Молекулярная физиология зрения в норме и при патологии
Результаты этапа: Основным научным направлением кафедры молекулярной физиологии является исследование молекулярных механизмов зрения. 1.Исследование фотохромных реакций ретиналь-содержащих белков – зрительного родопсина и бактериородопсина в фемто- и пикосекундной шкалах времён (совместно с ИХФ им. Н.Н.Семёнова РАН и ИБХФ им. Н.М.Эмануэля РАН). С использованием уникальной фемтосекундной трёхимпульсной лазерной системы с двумя возбуждающими импульсами и третьим зондирующим (импульс суперконтинуума) продолжено исследование фотохимии ретиналь-содержащих белков – зрительного и бактериального родопсинов. Проведено сравнение прямых и обратных фотохимических реакций ретиналь-содержащих белков в фемто-пикосекундных временных диапазонах. Сравнение показало, что квантовые выходы прямой реакции у бактериородопсина (переход полностью-транс ретиналя в 13-цис форму) и у зрительного родопсина (переход 11-цис ретиналя в полностью-транс форму) близки и равны 0.64 и 0.65, соответственно. В то же время квантовые выходы обратной фотореакции у них существенно различаются, а именно: 0.81 для перехода 13-цис в полностью-транс форму у бактериородопсина и 0.15 для перехода полностью-транс ретиналя в 11-цис форму у зрительного родопсина. Предполагается, что низкий квантовый выход обратной фотореакции в эволюционно более «молодом» зрительном родопсине повышает надёжность запуска процесса фототрансдукции (зрительного акта). Начато теоретическое исследование особенностей механизма фотоизомеризации хромофора в ретиналь-содержащих белках. В 2016 году совместно с математиками разработана квантово-классическая модель процесса фотоизомеризации хромофора в молекуле зрительного родопсина. Предложенная модель может быть использована для изучения механизма сверхбыстрой реакции фотоизомеризации ретиналевого хромофора в огромном семействе ретиналь-содержащих белков. Публикации: •Tatiana B. Feldman, Olga A. Smitienko, Ivan V. Shelaev, Fedor E. Gostev, Oksana V. Nekrasova, Dmitriy A. Dolgikh, Victor A. Nadtochenko, Mikhail P. Kirpichnikov, Mikhail A. Ostrovsky. Femtosecond spectroscopic study of photochromic reactions of bacteriorhodopsin and visual rhodopsin. // Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology. 164 (2016) 296–305. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2016.09.041. •В.Д. Лахно, А.С. Шигаев, Т.Б. Фельдман, В.А. Надточенко, М.А. Островский. Квантово-классическая модель реакции фотоизомеризации ретиналя в зрительном пигменте родопсине. // ДАН, 2016, том 471, № 5, с. 604–608. DOI: 10.7868/S0869565216350267 •О.А. Смитиенко, О.В. Некрасова, А.В. Кудрявцев, М.А. Яковлева, И.В. Шелаев, Ф.Е. Гостев, Д.А. Долгих, В.А. Надточенко, М.П. Кирпичников, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Фемто- и пикосекундная динамика первичных реакций рекомбинантного бактериородопсина в сравнении с природным белком в тримерном и мономерном состояниях. // Биохимия (принято в печать). 2. Исследование пространственной организации молекул зрительного родопсина как G-белок-связывающего рецептора в фоторецепторной мембране зрительных клеток (Совместно с Лабораторией нейтронной физики имени И.М. Франка Объединенного Института Ядерных Исследований, Дубна). Продолжено исследование супрамолекулярной организации фоторецепторной мембраны при помощи метода малоуглового рентгеновского рассеяния. Подтверждены данные, полученные методом малоуглового рассеяния нейтронов с вариацией контраста о том, что плотность упаковки молекул родопсина в фоторецепторной мембране необычайно высока: расстояние между центрами молекул составляет примерно 56 Å. На основании полученных данных сделано предположение о том, что родопсин в фоторецепторной мембране, скорее всего, находится в мономерной форме. Публикации: •M.A. Ostrovsky, T.B. Feldman, O.I. Ivankov, T.N. Murugova, A.I. Kuklin, M.A. Yakovleva, V.I. Gordeliy, A.V. Belushkin. Study of visual pigment rhodopsin supramolecular organization in photoreceptor membrane by SAXS and SANS. // Conference on small angle neutron scattering. Dedicated to the 80th anniversary of Yu.M. Ostanevich, Dubna, Russia, June 6-9, 2016. P. 62. 3. Сравнительно-физиологическое исследование природы хромофорной группы в зрительных пигментах креветок морской и озерной популяций Mysis relicta (совместно с Хельсинским Университетом и ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН). Определен изомерный состав ретиналей в зрительных пигментах креветок Mysis relicta (род Mysis; Mysida, Crustacea) морской и озёрной популяций, обитающих в различной световой среде в темноадаптированном и светоадаптированном состояниях. Изучена динамика темновой регенерации зрительных пигментов в глазах креветок Mysis relicta обеих популяций после облучения животных. Показано, что у креветок морской популяции процесс темновой регенерации протекает быстрее по сравнению с озерной. Публикации: •M. Yakovleva, T. Feldman, M. Lindström, K. Donner, M. Ostrovsky. A comparative study of rhodopsin “dark” regeneration in the eyes of opossum shrimps (Mysis relicta) from a sea and a lake population. // Visionarium XV- Tvärminne. Finland. 21-23 October. 2016. P. 37. •K. Donner, P. Zak, M. Viljanen, M. Lindström, T. Feldman, M. Ostrovsky. Eye spectral sensitivity in fresh- and brackish-water populations of three glacial-relict Mysis species (Crustacea): Physiology and genetics of differential tuning. // J Comp Physiol A. 2016. 202:297–312. DOI: 10.1007/s00359-016-1079-y 4. Флуорофоры липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия и развитие неинвазивного метода аутофлуоресценции глазного дна при диагностике старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки (совместно с ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН). Продолжены исследования при помощи метода масс-спектрометрии («травление» образца ионами цезия (Сs+)) пространственного распределения флуорофоров в липидном матриксе и в толще самой липофусциновой гранулы. Изменения пространственного распределения и состава флуорофоров при облучении липофусциновой гранулы видимым светом не были выявлены. Начаты исследования кинетических параметров флуоресценции липофусциновых гранул. Методом подсчета коррелированных по времени фотонов были определены значения времени жизни флуоресценции хлороформного экстракта липофусциновых гранул из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека при отсутствии видимых патологических признаков. Сравнительный анализ параметров времени жизни флуоресценции для бис-ретинилиденэтаноламина (А2Е) и продуктов его фотоокисления и фотодеградации показал, что вклад А2Е в суммарную флуоресценцию хлороформного экстракта липофусциновых гранул не является основным. Полученные результаты важны для усовершенствования неинвазивного метода диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия – аутофлуоресценция глазного дна. Публикации: •Marina A. Yakovleva, Alexander A. Gulin, Tatiana B. Feldman, Yuriy C. Bel’skich, Patimat M. Arbukhanova, Artem A. Astaf’ev, Victor A. Nadtochenko, Sergey A. Borzenok, Mikhail A. Ostrovsky. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry to assess spatial distribution of А2Е and its oxidized forms within lipofuscin granules isolated from human retinal pigment epithelium. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2016. 408:7521–7528. (DOI: 10.1007/s00216-016-9854-8). •Яковлева М.А., Лисицина Е.С., Арбуханова П.М., Борзенок С.А., Фельдман Т.Б., Островский М.А. К вопросу о развитии диагностического метода аутофлуоресценции глазного дна: компонентный спектральный анализ флуорофоров липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. В сб. Пролиферативный синдром в биологии и медицине. // Материалы II Российского конгресса с международным участием (30 ноября – 1 декабря 2016 г., г. Москва) – М.: РНИМУ им. Н. И. Пирогова, 2016. С. 92-94. •Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Арбуханова П.М., Борзенок С.А., Кузьмин В.А., Островский М.А. Определение времён жизни флуоресценции флуорофоров, содержащихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека без признаков патологии. // ДАН, 2017, том 472, № 2, с. DOI: 10.7868/S086956521702027X •Яковлева М.А., Арбуханова П.М., Фельдман Т.Б., Борзенок С.А., Островский М.А. Флуоресцентные свойства и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека в норме и в случае визуализируемой патологии. // Сборник тезисов 20-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 18-22 апреля 2016, С. 165. 5. Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки (совместно с ИБХ РАН и ИВНДиНФ РАН). Мы провели сравнительную характеристику каналов slow Chloc и ACR2 путем их экспрессии в нейронах мозга крысы методом in utero электропорации. Было обнаружено, что хотя оба канальных родопсина способны эффективно подавлять импульсную активность в нейронах, ACR2 характеризуется значительно более негативными значениями потенциала реверсии, что может означать более высокую селективность к ионам хлора у ACR2 по сравнению с SlowChloc. Кроме того, ACR2 характеризуется значительно более быстрой кинетикой инактивации, что делает этот канал более предпочтительным для точного управления нейронной активностью в оптогенетических экспериментах. Публикации: •Д.А. Долгих, А.Ю. Малышев, М.В. Рощин, Г.Р. Смирнова, О.В. Некрасова, Л.Е. Петровская, Т.Б. Фельдман, П.М. Балабан, М.П. Кирпичников, М.А. Островский. Сравнительная характеристика двух анионных канальных родопсинов и перспективы их применения в оптогенетике. // ДАН, 2016, том 471, № 6, с. 729–731.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Молекулярная физиология зрения в норме и при патологии
Результаты этапа: Основным научным направлением кафедры молекулярной физиологии является исследование молекулярных механизмов зрения. 1.Исследование фотохромных реакций ретиналь-содержащих белков – зрительного родопсина и бактериородопсина в фемто- и пикосекундной шкалах времён (ИХФ РАН, ИБХФ РАН и ИБХ РАН). С использованием уникальной фемтосекундной трёхимпульсной лазерной системы с двумя возбуждающими импульсами и третьим зондирующим (импульс суперконтинуума) продолжено исследование фотохимии ретиналь-содержащих белков – зрительного и бактериального родопсинов. Впервые зарегистрирована сверхбыстрая фотореакция нового ретиналь-содержащего белка Exiguobacterium sibiricum. Определены скорости образования первичных фотопродуктов прямой реакции в их основном состоянии. Проведено сравнение параметров фотоиндуцированных реакций нового ретиналь-содержащего белка Exiguobacterium sibiricum с уже имеющимися данными в отношении сверхбыстрой фотореакции бактериородопсина из Halobacterium salinarum. Зарегистрирована динамика фотореакции рекомбинантного бактериородопсина, модифицированного по тирозину (Y185F) в хромофорном центре. Определена скорость образования продукта прямой реакции К в его основном состоянии. Проведено сравнение эффективности фотоперехода этого модифицированного по тирозину бактериородопсина по сравнению с его рекомбинантной немодифицированной формой. Продолжено теоретическое исследование особенностей механизма фотоизомеризации хромофора в ретиналь-содержащих белках. Ранее совместно с математиками была разработана квантово-классическая модель процесса фотоизомеризации хромофора в молекуле зрительного родопсина. В 2017 году более полное исследование позволило также сделать ряд важных выводов о взаимном влиянии квантового состояния и молекулярной решетки хромофора родопсина, в частности о роли диссипации избыточной энергии фотовозбуждения в фотореакции. Предложенная модель может быть использована для изучения механизма сверхбыстрой реакции фотоизомеризации ретиналевого хромофора в огромном семействе ретиналь-содержащих белков. Публикации: О.А. Смитиенко, О.В. Некрасова, А.В. Кудрявцев, М.А. Яковлева, И.В. Шелаев, Ф.Е. Гостев, Д.А. Долгих, И.Б. Кольчугина, В.А. Надточенко, М.П. Кирпичников, Т.Б. Фельдман, М.А. Островский. Фемто и пикосекундная динамика первичных реакций рекомбинантного бактериородопсина в сравнении с природным белком в тримерном и мономерном состояниях. // Биохимия, 2017, том 82, вып. 4, с. 664–676; A. S. Shigaev, T. B. Feldman, V. A. Nadtochenko, M. A. Ostrovsky, V. D. Lakhno. New insight into the dynamics of rhodopsin photoisomerization from one-dimensional quantum-classical modeling. // Послана в печать. Phys. Rev. E (2017). 2. Исследование пространственной организации молекул зрительного родопсина как G-белок-связывающего рецептора в фоторецепторной мембране зрительных клеток (Совместно с Лабораторией нейтронной физики имени И.М. Франка ОИЯИ, Дубна). Продолжено исследование супрамолекулярной организации фоторецепторной мембраны при помощи методов малоуглового рентгеновского рассеяния и малоуглового рассеяния нейтронов. Получены новые данные, подтверждающие предположение о том, что в фоторецепторной мембране, отсутствует регулярная упаковка димеров родопсина. Скорее всего, молекулы зрительного пигмента расположены в мембране диффузно в мономерной форме. Подготовлена к публикации статья: T.B. Feldman, O.I. Ivankov, A.I. Kuklin, T.N. Murugova, M.A. Yakovleva, O.A. Smitienko, A. Round, V.I. Gordeliy, A.V. Belushkin, M.A. Ostrovsky. Small angle neutron and X-ray solution scattering to assess supramolecular organization of visual pigment rhodopsin in photoreceptor membranes. 3. Сравнительное исследование механизмов темновой адаптации в глазах креветок морской и озерной популяций Mysis relicta (совместно с Хельсинским Университетом и ИБХФ РАН). Продолжено изучение механизмов темновой регенерации зрительных пигментов креветок Mysis relicta (род Mysis; Mysida, Crustacea) морской и озёрной популяций, обитающих в различной световой среде в темноадаптированном и светоадаптированном состояниях. Изучена динамика изменения содержания ретинола в глазах креветок Mysis relicta обеих популяций после облучения животных и темновой адаптации. Показано, что сразу после облучения наблюдается резкое повышение содержания ретинола в глазах креветок обеих популяций, однако у озерных креветок содержание ретинола практически в 2 раза выше по сравнению с морской. В процессе темновой адаптации наблюдается заметное понижение содержания ретинола. При этом следует отметить, что относительное содержание 11-цис изомера ретинола понижается, а транс-ретинола увеличивается. Этот результат коррелирует с изменением относительного содержания 11-цис ретиналя (увеличение) и транс-ретиналя (уменьшение) в процессе темновой регенерации зрительного пигмента. Подготовлена к публикации статья: T.B. Feldman, M.A. Yakovleva, M. Lindstem, K. Donner, M.A. Ostrovsky. A comparative study of the mechanisms of dark adaptation in the eyes of sea and lake populations of shrimps Mysis relicta. 4. Флуорофоры липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия и развитие неинвазивного метода аутофлуоресценции глазного дна при диагностике старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки (совместно с ИБХФ РАН и МНТК «Микрохирургии глаза»). Продолжены исследования кинетических параметров флуоресценции липофусциновых гранул. Методом подсчета коррелированных по времени фотонов были определены значения времени жизни флуоресценции липофусциновых гранул в суспензии клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека как при отсутствии видимых патологических признаков, так и в случае визуализированной патологии ВМД. Показано, что в случае визуализированной патологии вклад продуктов фотоокисления и фотодеградации бис-ретиноидов в суммарную флуоресценцию суспензии клеток ретинального пигментного эпителия превышал таковой при нормальном зрении. Полученные результаты важны для усовершенствования неинвазивного метода диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия – аутофлуоресценция глазного дна. Публикации: Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Арбуханова П.М., Борзенок С.А., Кузьмин В.А., Островский М.А. Определение времени жизни флуоресценции флуорофоров, содержащихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека без признаков патологии. // ДАН, 2017, том 472, № 2, с. 226–229; М.А. Яковлева, Т.Б. Фельдман, П.М. Арбуханова, С.А. Борзенок, В.А. Кузьмин, М.А. Островский. Время жизни флуоресценции флуорофоров, содержащихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека, в норме и в случае визуализируемой патологии. // ДАН, 2017, том 474, № 6, с. 760–765; Яковлева М.А., Донцов А.Е., Сакина Н.Л., Арбуханова П.М., Фельдман Т.Б., Борзенок С.А., Островский М.А. Механизмы окислительного действия света на липофусциновые гранулы из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека: роль супероксидных радикалов. // Сенсорные системы. 2017. Т. 31, № 3, С. 227–236; Арбуханова П.М., Борзенок С.А., Яковлева М.А., Фельдман Т.Б., Кузьмин В.А., Островский М.А. Критерии визуализируемой патологии сетчатки и ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека. Исследование флуоресценции флуорофоров, содержащихся в липофусциновых гранулах клеток РПЭ кадаверных глаз. // Современные технологии в офтальмологии. 2017, Выпуск № 3 (16), С. 100-102. ISSN: 2312-4911. 5. Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки (совместно с ИБХ РАН и ИВНДиНФ РАН). Проведена сравнительная характеристика двух хлорных родопсиновых каналов (slow Chloc и ACR2) путем их экспрессии в нейронах мозга крысы методом in utero электропорации. Показано, что хотя оба канальных родопсина способны эффективно подавлять импульсную активность в нейронах, канал ACR2 характеризуется значительно более негативными значениями потенциала реверсии по сравнению с SlowChloc. Это может означать более высокую селективность у ACR2 к ионам хлора Кроме того, ACR2 характеризуется значительно более быстрой кинетикой инактивации. В совокупности это означает, что этот ACR2 канал более предпочтителен для управления нейронной активностью в экспериментах с использованием оптогенетических светочувствительных инструментов. Результаты этих экспериментов будут использованы для эффективного создания on-off рецептивного поля ганглиозных клеток при протезировании дегенеративной сетчатки глаза. Публикация:Malyshev A.Y., Roshchin M.V., Smirnova G.R., Dolgikh D.A., Balaban P.M., Ostrovsky M.A. Chloride conducting light activated channel GtACR2 can produce both cessation of firing and generation of action potentials in cortical neurons in response to light. Neuroscience Letters. 2017, 640, 76–80. 6. Каротиноиды в тканях глаза человека. Было исследовано содержание каротиноидов и их окисленных форм в стекловидном теле, сетчатке и хрусталике глаза в ходе пренатального развития человека (совместно с ИБХФ РАН и ИБР РАН). По материалам исследования опубликована статья: Panova I.G., Yakovleva M.A., Tatikolov A.S., Kononikhin A.S., Feldman T.B., Poltavtseva R.A., Nikolaev E.N., Sukhikh G.T., Ostrovsky M.A. Lutein and its oxidized forms in eye structures throughout prenatal human development. Exp Eye Res. 2017. V. 160, P. 31-36.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Молекулярная физиология зрения в норме и при патологии
Результаты этапа: Основным научным направлением кафедры молекулярной физиологии является исследование молекулярных механизмов зрения. 1. Продолжено изучение сверхбыстрой прямой фотореакции нового ретиналь-содержащего белка Exiguobacterium sibiricum (ESR). Динамика фотореакции ESR была исследована методом фемтосекундной абсорбционной лазерной спектроскопии. В работе были зарегистрированы дифференциальные спектры фотоиндуцированного поглощения Exiguobacterium sibiricum (ESR) при возбуждении импульсами длительностью 25 фс и зондировании в широком диапазоне длин волн (400-900 нм) на временах задержки до 20 пс. Было проведено разложение время-разрешенных данных на спектральные компоненты с определенным временем жизни (анализ глобального соответствия). Показано, что первичные реакции ESR характеризуется сложной структурой возбужденного состояния и многоканальным образованием продукта, как в фемто-, так и в пикосекундном временных диапазонах. Для ESR разложение на спектральные компоненты выявило наличие трех возбужденных состояний с характерными временами жизни 0.27, 0.88 и 5.9 пс. Подготовлена к печати статья O.A. Smitienko, L.E. Petrovskaya, M.A. Yakovleva, O.V. Nekrasova, I.B. Kolchugina, I.V. Shelaev, F.E. Gostev, D.A. Dolgikh, V.A. Nadtochenko, M.P. Kirpichnikov, T.B. Feldman, M.A. Ostrovsky. Femtosecond and picosecond dynamics of Exiguobacterium sibiricum rhodopsin primary photoreactions. // J. Photochem. Photobiol. Продолжено изучение влияния консервативного аминокислотного остатка тирозина в активном центре ретиналь-содержащих белков (Tyr185 в бактериородопсине) в регуляции начальных стадий фотоцикла микробиальных родопсинов. Получена двойная мутантная форма Tyr185Phe/Trp86Phe бактериородопсина, модифицированного по тирозину Tyr185Phe в хромофорном центре и триптофану Trp86Phe. Проведен сравнительный спектральный анализ двойной мутантной формы бактериородопсина с его рекомбинантной немодифицированной формой. Подготовлена к печати статья A.V. Kudriavtsev, O.A. Smitienko, M.A. Yakovleva, O.V. Nekrasova, I.B. Kolchugina, I.V. Shelaev, F.E. Gostev, D.A. Dolgikh, V.A. Nadtochenko, M.P. Kirpichnikov, T.B. Feldman, M.A. Ostrovsky. Electron coupling between retinal and Y185 lead to red schift and more stable excited state of bacteriorhodopsin. // J. Photochem. Photobiol. Завершено теоретическое исследование особенностей механизма фотоизомеризации хромофора в ретиналь-содержащих белках. Предложена квантово-классическая модель цис-транс фотоизомеризации родопсинового хромофора (ретиналя) в широких диапазонах параметров. Путём численных исследований модели доказан элементарный характер фотоизомеризации хромофора и узкая локализация смещений атомных групп ретиналя. Результаты расчетов опубликованы в статье: Шигаев А.С., Фельдман Т.Б., Надточенко В.А., Островский М.А., Лахно В.Д. Исследование фотоизомеризации хромофора родопсина на основе квантово-классической модели. // Математическая биология и биоинформатика, 2018, Т. 13, № 1, С. 169-186. 2. Исследование пространственной организации молекул зрительного родопсина как G-белок-связывающего рецептора в фоторецепторной мембране зрительных клеток (совместно с ОИЯИ, Дубна). Методом малоуглового рассеяния нейтронов и малоуглового рентгеновского рассеяния продолжено изучение супрамолекулярной организации родопсина в фоторецепторной мембране. Проведена сравнительная оценка межмолекулярных расстояний родопсина в мембране нативного изолированного фоторецепторного диска в темновом состоянии и нативного фоторецепторного диска в составе наружных сегментов фоторецепторных клеток. Подтверждена ранее обнаруженная плотная упаковка молекул родопсина в фоторецепторной мембране и показано отсутствие упорядоченных структур молекул зрительного пигмента. Подготовлена к печати статья: T.B. Feldman, O.I. Ivankov, A.I. Kuklin, T.N. Murugova, M.A. Yakovleva, O.A. Smitienko, I.B. Kolchugina, A. Round, V.I. Gordeliy, A. V. Belushkin, M.A. Ostrovsky. Small-angle neutron and X-ray scattering analysis of the supramolecular organization of rhodopsin in photoreceptor membranes. // ВВА-biomembranes. 2018. 3. Сравнительное исследование механизмов темновой адаптации в глазах креветок морской и озерной популяций Mysis relicta (совместно с Хельсинским Университетом и ИБХФ РАН). Продолжено изучение динамики изменения изомерного состава ретинола, предшественника хромофора зрительных пигментов, а также самого хромофора – ретиналя, в ходе темновой адаптации в глазах креветок Mysis relicta обеих популяций. Показано, что при облучении количество транс-ретиналя меняется незначительно, в 1,5 раза, в то время как содержание 11-цис ретиналя уменьшается в 11-18 раз. Можно предположить, что изомеризованный 11-цис ретиналь в транс-форму восстанавливается до ретинола, аналогично механизму в зрительном цикле позвоночных. Подготовлена к печати статья: T. Feldman, M. Yakovleva, M. Viljanen, M.Lindström, K. Donner, M. Ostrovsky. Dark adaptation in the eyes of a lake and a sea population of opossum shrimp (Mysis relicta): retinoid isomer dynamics, rhodopsin regeneration, and recovery of light sensitivity. // J. Comp. Phys. 2018. 4. Флуорофоры липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия и развитие неинвазивного метода аутофлуоресценции глазного дна для диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки (совместно с ИБХФ РАН и ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России). Впервые предложен способ ранней доклинической диагностики возрастной макулярной дегенерации сетчатки, основанный на спектральном анализе аутофлуоресценции глазного дна. Принципы такой диагностики изложены в статье [Tatiana B. Feldman, Marina A. Yakovleva, Andrey V. Larichev, Patimat M. Arbukhanova, Alexandra Sh. Radchenko, Sergey A. Borzenok, Vladimir A. Kuzmin, Mikhail A. Ostrovsky. Spectral analysis of fundus autofluorescence pattern as a tool to detect early stages of degeneration in the retina and retinal pigment epithelium. // EYE, 2018, 32:1440–1448], а также патентах РФ на изобретение [№ 2651126 (18.04.2018); Фельдман Т.Б., Островский М.А., Яковлева М.А., Ларичев А.В., Борзенок С.А., Арбуханова П.М. Способ раннего выявления возрастной макулярной дистрофии сетчатки] и полезную модель [№ 176795 (29.01.2018); Ларичев А.В., Панченко В. Я., Островский М.А., Фельдман Т.Б. Оптическое устройство для исследования глазного дна с целью выявления возрастной макулярной дистрофии сетчатки]. Методом подсчета коррелированных по времени фотонов с использованием 2D анализа зарегистрированы кинетики затухания флуоресценции хлороформного экстракта липофусциновых гранул с целью выявления различных групп флуорофоров и определения их вклада в суммарную флуоресценцию. Подготовлена и послана в журнал статья: M.A. Yakovleva, A.Sh. Radchenko, T.B. Feldman, A.A. Kostyukov, P.M. Arbukhanova, S.A. Borzenok, V.A. Kuzmin, M.A. Ostrovsky. Contribution of lipofuscin oxidized bisretinoids from RPE to the autofluorescence decay kinetics is an important indication for the FLIM data analysis. // Acta Ophthalmologica. 2018. 5. Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки (совместно с кафедрой биоинженерии Биологического факультета МГУ, ИБХ РАН и ИВНДиНФ РАН). Продолжены экспериментальные исследования, результаты которых станут основой для создания on-off рецептивного поля ганглиозных клеток при протезировании дегенеративной сетчатки глаза. Обобществлены собственные и литературные данные, касающиеся перспектив оптогенетического протезирование дегенеративной (слепой) сетчатки, и на этой основе подготовлена и сдана в печать в журнал «БИОХИМИЯ» статья-обзор: М.А. Островский и М.П. Кирпичников «Перспективы оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки глаза» (Биохимия, 2019).
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Молекулярная физиология зрения в норме и при патологии
Результаты этапа: Основным научным направлением кафедры молекулярной физиологии является исследование молекулярных механизмов зрения. 1. Исследование фотохромных реакций ретиналь-содержащих белков – зрительного родопсина и бактериородопсина в фемто- и пикосекундной шкалах времён (совместно с ИХФ РАН, ИБХФ РАН и ИБХ РАН). Получена кодирующая последовательность гена родопсина человека и проведено клонирование в вектор для бакуловирусной экспрессии. Получен рекомбинантный родопсин и исследованы его спектральные свойства. Продолжено изучение сверхбыстрой прямой фотореакции нового ретиналь-содержащего белка Exiguobacterium sibiricum (ESR). Первичные стадии фотоцикла рекомбинантного ESR в мономерной форме исследованы методом «возбуждение-зондирование» фемтосекундной абсорбционной лазерной спектроскопии в спектральном диапазоне 400-900 нм c временным разрешением 25 фс при рН 7.5. Проведено сравнение динамики первичных реакций ESR с наиболее изученным в настоящее время ретиналь-содержащим белком бактериородопсином в его нативной тримерной и рекомбинантной мономерной формах. Можно заключить, что ESR по динамике первичных реакций, а также по характеру темновой адаптации, ближе к протеородопсинам, чем к бактериородопсину. Подготовлена к печати статья [O.A. Smitienko, T.B. Feldman, L.E. Petrovskaya, M.A. Yakovleva, O.V. Nekrasova, I.B. Kolchugina, I.V. Shelaev, F.E. Gostev, D.A. Cherepanov, D.A. Dolgikh, V.A. Nadtochenko, M.P. Kirpichnikov, M.A. Ostrovsky. Primary Reactions of Exiguobacterium sibiricum Rhodopsin (ESR). // J. Photochem. Photobiol. 2020]. Теоретическое обоснование роли Y185 в спектральной настройке бактериородопсина. Проведен QМ/ММ анализ рекомбинантного бактериородопсина (БРрек) и мутантного (БРмут) Y185F. В результате QМ/ММ анализа были рассчитаны высшая занятая молекулярная орбиталь (ВЗМО), на которой находится электрон с наиболее высокой энергией, и низшая свободная молекулярная орбиталь (НСМО), куда переходит электрон с ВЗМО после фотовозбуждения, для мономера БРрек и его мутанта Y185F. Проанализированная электронная структура активного центра в БРрек и БРмут Y185F свидетельствует о том, что в активном центре присутствует электронное сопряжение между Y185 и ретиналем. При этом, как видно из расчётов возбужденных молекулярных орбиталей, когда сопряжение теряется (в случае с мутантной формой), это оказывает влияние на распределение зарядов вдоль молекулы ретиналя: в случае возбужденного состояния электронная плотность оттягивается ближе к Шиффову основанию, в свою очередь бета-иононовое кольцо становится частично положительно заряженным. Таким образом, результаты расчетов указывают на то, что Y185 играет важную роль в стабилизации ретиналя и спектральной настройке бактериородопсина. 2. Исследование нарушений в периферическом (сетчатка глаза) и центральных отделах зрительной системы на молекулярном и поведенческом уровнях в результате действия ионизирующего излучения (совместно с Лабораторией радиационной биологии ОИЯИ (Дубна), ИБХФ РАН и кафедрой высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова). Начато новое направление в изучении молекулярных механизмов зрения: влияние ионизирующего излучения на структуры глаза и зрительное поведение. Проведен флуоресцентный и хроматографический анализ бисретиноидов из сетчатки и ретинального пигментного эпителия глаз мышей до и после воздействия на них ускоренными протонами в пике Брэгга. Полученные спектральные и хроматографические данные свидетельствуют о том, что воздействие на мышей ускоренными протонами в пике Брэгга в дозах 1-4 Гр приводит в тканях глаза к радиационному окислению бисретиноидов. Опубликована статья [Яковлева М.А., Ляхова К.Н., Утина Д.М., Виноградова Ю.В., Колесникова И.А., Фельдман Т.Б., Островский М. А. Изменение состава и флуоресцентных свойств бисретиноидов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии глаза мыши при действии ионизирующего излучения. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2019. Т. 59. № 2. С. 249 – 254]. Произведена оценка оптомоторного рефлекса и зрительного поведения у крыс, подвергнутых воздействию протонами в дозе 5 Гр. В отдаленный период после облучения были обнаружены статистически значимые изменения в зрительном поведении облученных животных. Установлено, что у облученных животных на 90 стуки после облучения наблюдается дефицит сосредоточения внимания на визуальном стимуле. Опубликована статья [Северюхин Ю.С., Фельдман Т.Б., Островский М.А., Молоканов А.Г. Влияние краниального облучения протонами 170 МэВ в дозе 5 Гр на зрительное поведение и оптомоторный ответ половозрелых крыс. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2019. Т. 59. № 5. С. 517 – 522]. На одной обезьяне (Macaca mulatta) проведено пилотное исследование по воздействию однократного краниального облучения протонами высокой энергии (170 МэВ, доза 3 Гр) на выполнение зрительного инструментального условного рефлекса. Спустя два месяца после облучения обнаружено достоверное снижение долей корректных реакций, совершаемых правой рукой. Выявленная динамика долей мануальных реакций свидетельствует о возможных кратковременных нарушениях в процессах координации глаз-рука, предположительно также затрагивая исполнительные механизмы. Опубликована статья [Латанов А.В., Терещенко Л.В., Островский М.А. Влияние краниального облучения протонами высоких энергий на зрительно-моторное инструментальное поведение обезьян. // Доклады Академии наук, 2019 том 487, № 5, с. 588-591]. 3. Сравнительное исследование механизмов темновой адаптации в глазах креветок морской и озерной популяций Mysis relicta (совместно с Хельсинским Университетом и ИБХФ РАН). Продолжено изучение динамики изменения изомерного состава ретинола, предшественника хромофора зрительных пигментов, в ходе темновой адаптации в глазах креветок Mysis relicta обеих популяций. Результаты исследования динамики изменения содержания ретинола при темновой адаптации позволяют предположить, что транс-ретиналь, образовавшийся в результате фотоизомеризации 11-цис ретиналя, быстро восстанавливается до ретинола, аналогично тому, как это происходит в зрительном цикле позвоночных. Это означает, что у креветок Mysis relicta вполне вероятен ферментативный путь регенерации родопсина. Разработан метод ВЭЖХ анализа ретинил пальмитата для получения полной картины метаболизма ретиналя при темновой регенерации зрительного пигмента. Подготовлена к печати статья: [T. Feldman, M. Yakovleva, M. Viljanen, M.Lindström, K. Donner, M. Ostrovsky. Dark adaptation in the eyes of a lake and a sea population of opossum shrimp (Mysis relicta): retinoid isomer dynamics, rhodopsin regeneration, and recovery of light sensitivity. // J. Comp. Phys. 2020]. 4. Флуорофоры липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия и развитие неинвазивного метода аутофлуоресценции глазного дна для диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки (совместно с ИБХФ РАН и ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России). Проведено сравнительное исследование фототоксических свойств неокисленных и окисленных бисретиноидов липофусциновых гранул из клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на пероксидацию липидов наружных сегментов фоторецепторных клеток. Показано, что окисленные бисретиноиды липофусциновых гранул менее фототоксичны по сравнению с их неокисленными формами. Проведен сравнительный анализ фототоксичных свойств липофусциновых гранул, содержащих нативный состав бисретиноидов и липофусциновых гранул, предварительно облученных синим светом с повышенным содержанием продуктов фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов с использование модельной системы культуры клеток РПЭ. Цитологический анализ показал, что продукты фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов в составе липофусциновых гранул также являются менее фототоксичными по сравнению с неокисленными бисретиноидами. Опубликована статья [Яковлева М.А., Сакина Н.Л., Кольчугина И.Б., Арбуханова П.М., Борзенок С.А., Фельдман Т.Б., Островский М.А. Сравнительное исследование оксидантных свойств окисленных и неокисленных бисретиноидов липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия глаза человека. // Патогенез. 2019. Т. 17. № 1. С. 66-71]. 5. Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки (совместно с кафедрой биоинженерии Биологического факультета МГУ, ИБХ РАН и ИВНДиНФ РАН). Подготовлено теоретическое обоснование для применения конкретных методов современной оптогенетики для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки. Данный материал изложен в опубликованных статьях [М.А. Островский, М.П. Кирпичников. Перспективы оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки глаза. // Биохимия. 2019. Т. 84. Вып. 5. С. 634 – 647; М.П. Кирпичников, М.А. Островский. Оптогенетика и зрение. // Вестник РАН. 2019. Т. 89. № 2. С. 125 – 130; Малышев А.Ю., Островский М.А. Опыт применения оптогенетических подходов к исследованию функций мозга и протезированию дегенеративной сетчатки. // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. 2019. Т. 105. № 11. С. 1406–1416]. 6. Исследование пространственной организации молекул зрительного родопсина как G-белок-связывающего рецептора в фоторецепторной мембране зрительных клеток (совместно с ОИЯИ (Дубна) и МФТИ). Закончено исследование пространственной организации молекул зрительного пигмента родопсина в фоторецепторной мембране методом малоуглового рассеяния нейтронов и малоуглового рентгеновского рассеяния. Подтверждена ранее обнаруженная плотная упаковка молекул родопсина в фоторецепторной мембране и показано отсутствие упорядоченных структур молекул зрительного пигмента. Опубликована статья [T.B. Feldman, O.I. Ivankov, A.I. Kuklin, T.N. Murugova, M.A. Yakovleva, O.A. Smitienko, I.B. Kolchugina, A.Round, V.I. Gordeliy, A.V. Belushkin, M.A. Ostrovsky. Small-angle neutron and X-ray scattering analysis of the supramolecular organization of rhodopsin in photoreceptor membrane. // BBA – Biomembranes, Volume 1861, Issue 10, (2019) 183000, DOI: 10.1016/j.bbamem.2019.05.022].
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Молекулярная физиология зрения в норме и при патологии
Результаты этапа: 1) Исследование зрительных и микробиальных родопсинов. А) Продолжено исследование фотохимических свойств нового ретиналь-содержащего белка Exiguobacterium sibiricum. Были получены рекомбинантный бактериородопсин Exiguobacterium sibiricum (ESR) и рекомбинантный бактериородопсин Halobacterium salinarum. Проведен сравнительный анализ их спектральных свойств, изомерного состава ретиналя в темновой и светоадаптированной форме, а также исследование фемтосекундной динамики фотохимических реакций этих микробиальных родопсинов. Показано, что первичные интермедиаты фотоцикла ESR аналогичны интермедиатам I, J и K фотопревращения бактериородопсина. Полученные результаты свидетельствуют об уникальной структуре хромофорного центра в микробиальных родопсинах, которая практически не изменилась в ходе эволюции. Это предположение подтверждается результатами сравнительного фемтосекундного спектроскопического анализа динамики и механизмов фотореакции изученных микробиальных родопсинов, бактериородопсина и ESR. Б) Был продолжен поиск условий для разработки метода получения рекомбинантного родопсина человека. Была осуществлена оптимизация генетической конструкции рекомбинантного опсина путем введения дополнительной С-концевой полигистидиновой (His12) последовательности; проведено детальное исследование уровня мембранной экспрессии рекомбинантного опсина в бакуловирусной системе экспрессии при различных условиях культивирования клеток Sf9; проведено тестовое выращивание белка в культуре клеток Sf9 в оптимизированных условиях с последующим выделением его из биомассы. Получение очищенного белка детектировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ, иммуноблоттинга и аналитической гель-фильтрации. Планируется дальнейшая разработка улучшенной методики очистки родопсина, которая позволит получить несколько мг родопсина, способного функционировать как нативный белок. 2) Исследование действия ионизирующего излучения на сетчатку и ретинальный пигментный эпителий глаза мыши. Проведен сравнительный флуоресцентный и хроматографический анализ бисретиноидов из сетчатки и ретинального пигментного эпителия глаза мыши после воздействия на животных гамма-лучами или ускоренными протонами. Сравнительное исследование воздействия различных видов ионизирующего излучения показал, что у протонов выше биологическая эффективность поражающего действия примерно в 3 раза по сравнению с гамма-лучами. 3) Сравнительное исследование механизмов темновой адаптации в глазах креветок морской и озерной популяций Mysis relicta. Исследована динамика изменения изомерного состава ретинил-пальмитата и ретинола в глазах креветок озерной популяции как при темновой адаптации, так и после их облучения. Показано, что сразу после облучения наблюдается резкое повышение содержания ретинола в глазах креветок обеих популяций, однако у озерных креветок содержание ретинола практически в 2 раза выше по сравнению с морской. В процессе темновой адаптации наблюдается заметное понижение содержания ретинола. При этом следует отметить, что относительное содержание 11-цис изомера ретинола понижается, а транс-ретинола увеличивается. Этот результат коррелирует с изменением относительного содержания 11-цис ретиналя (увеличение) и транс-ретиналя (уменьшение) в процессе темновой регенерации зрительного пигмента. Показано, что при облучении происходит резкое повышение уровня содержания транс-ретиниловых эфиров, которые в ходе темновой адаптации переходят в форму 11-цис ретиниловых эфиров. В свою очередь 11-цис ретиниловые эфиры являются предшественниками (источником) 11-цис ретиналя, необходимого для регенерации родопсина в темноте. В то же время эффективность процесса фоторегенерации родопсина у этих креветок весьма низкая. На основании этих результатов можно предположить, что основным путем регенерации зрительного пигмента у озерной популяции Mysis relicta является процесс темновой регенерации, т.е., в основном, имеет место синтез молекул родопсина de novo в их фоторецепторных клетках (рабдомах), а не процесс фоторегенерации. 4) Флуорофоры липофусциновых гранул РПЭ и развитие неинвазивного метода аутофлуоресценции глазного дна для диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки. Получены флуоресцентные характеристики группы неокисленных бисретиноидов и группы продуктов фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов. Показано, что окисленные бисретиноиды липофусциновых гранул менее фототоксичны по сравнению с их неокисленными формами. Также проведен сравнительный анализ фототоксичных свойств липофусциновых гранул, содержащих нативный состав бисретиноидов и липофусциновых гранул с повышенным содержанием продуктов фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов с использование модельной системы культуры клеток РПЭ. Цитологический анализ показал, что продукты фотоокисления и фотодеградации бисретиноидов в составе липофусциновых гранул также являются менее фототоксичными по сравнению с неокисленными бисретиноидами. 5) Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки. В результате проведенной работы были созданы экспрессионные векторы, несущие гены катионных (ChR2) и анионных (ACR2) канальных родопсинов вместе с кодирующими последовательностями экспортных и "нацеливающих" мотивов, обеспечивающих направленную субклеточную локализацию встраиваемых опсинов. Были получены векторы, кодирующие ChR2 с N- или С-концевыми мотивами PSD95.FingR для периферической локализации канального родопсина ChR2, тогда как для периферической локализации GtACR2 в дендритах был использован мотив миозин-связывающего домена меланофилина (MBD), слитый с С-концом гибридного белка. Был осуществлен дизайн, сборка, амплификация и клонирование в экспрессионный вектор гена родопсина колбочек человека (MW-опсина), обладающего качественно новыми свойствами (высокой светочувствительности, быстрой кинетики, способностью адаптироваться к изменениям интенсивности светового потока), выгодно отличающего этот белок от известных ранее светочувствительных белков, применявшихся в оптогенетике. Преимущества MW-опсина указывают на его применимость для экспрессии в ГК, что является принципиально важным для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".