Хроматин как бионаносистемаНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Hi-C библиотеки из каждого клеточного типа были подготовлены в двух независимых повторностях с использованием эндонуклеазы рестрикции MboI и секвенированы на платформе Illumina HiSeq по 70 млн парных ридов на образец. Полученные данные были выровнены на референсный геном дрозофилы (dm3), итеративно корректированы и бинированы по 20 т.п.н. Коэффициент корреляции Пирсона для биологических повторов был порядка 0.87, поэтому для дальнейшего анализа данные реплик были слиты в единый пул. На первом этапе анализа полученных данных мы осуществили поиск ТАДов с использованием алгоритма Greendale. Было картировано порядка 650 ТАДов размером от 60 до 460 т.п.н., покрывающих около 66% генома, что согласуется с ранее полученными данными по культивируемым клеточным линиям. Порядка 50% ТАДов имеют идентичные позиции в сперматоцитах, сперматогониях и соматических клетках S2, консервативность позиций ТАДов между сперматоцитами и сперматогониями – около 75%. Как интегральный параметр, характеризующий степень плотности укладки хроматина в масштабе генома, мы рассчитывали среднюю частоту контактов регионов генома, расположенных на заданном расстоянии друг от друга (скейлинг). Анализ скейл-плотов показывает, что в герминальных клетках, по сравнению с соматической клеточной линией S2, обогащены контакты на малых и средних расстояниях (около 10-50 т.п.н.), и обеднены дальние контакты (на расстояниях больше 100 т.п.н.). Кроме того, наклон кривой в герминальных клетках больше, чем в S2. Это говорит о большей компактности ТАДов в герминальных клетках, чем в соматических, что согласуется с тем, что в сперматогониях (и в большей степени в сперматоцитах) начинаются процессы репрессии транскрипции и конденсации хроматина, предшествующие формированию зрелых ядер сперматозоидов. Ранее было показано, что участки генома дрозофилы, содержащие неактивные гены и привлекаемые в приламинарный репрессионный компартмент ядра в соматических клетках (ламин-ассоциированные домены, ЛАДы), как правило расположены внутри ТАДов. Мы использовали ранее опубликованные результаты картирования ЛАДов в сперматогониях методом DamID с тем, чтобы проверить их расположение относительно топологических доменов. Для этого мы рассчитали обогащение сигнала DamID внутри ТАДов и интер-ТАДов, используя z-score в качестве меры обогащения. Как и ожидалось, в сперматогониях лам¬ин-ассоциированные домены также оказались локализованы преимущественно в ТАДах. Мы провели статистический анализ уровня транскрипции ССГ в семенниках личинок III возраста по опубликованным данным (Chintapalli et al. 2007). Скрипичные диаграммы показывают высокую гетерогенность ССГ (являющихся тканеспецифичными генами) по уровню транскрипции. Распределение ССГ между ТАДами и интер-ТАДами в целом оказалось неожиданным. Из результатов многих работ, выполненных как на млекопитающих, так и на дрозофиле, следует, что активные гены располагаются главным образом в интер-ТАДах, а неактивные – внутри топологических доменов. Большинство ССГ в герминальных клетках располагаются в ТАДах (72%), при этом нет никакой зависимости между уровнем транскрипции данного семенник-специфичного гена и расположением его в ТАДе или интер-ТАДе: и активно экспрессирующиеся ССГ, и практически молчащие как правило расположены внутри топологических доменов. Мы предполагаем, что, поскольку ССГ обычно короткие и располагаются одиночно, транскрибируемая область хроматина, ими образуемая, не достаточна для возникновения на этом месте границы домена и превращению её в интер-ТАД, возникающий обычно там, где высока плотность активно транскрибируемых генов.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Работа в 2017 году была посвящена изучению пространственной организации генома Dictyostelium. Dictyostelium discoideum – миксомицет, чередующий в своём жизненном цикле одноклеточную и многоклеточную стадии. Был проведён HiC-эксперимент по картированию топологии генома свободноживущих клеток Dictyostelium, выполнен биоинформатический анализ данных, и предложена 3D-модель организации генома Dictyostelium. Мы также отработали систему дифференцировки и до завершения текущего календарного года планируем провести HiC-анализ топологии генома преспоровых и соматических клеток. На первом этапе работы нами были отработаны условия культивирования Dictyostelium на бактериальном газоне E. coli (штамм DH5α) на SM-агаре. Этот метод оказался оптимальным для выведения культуры из замороженного в жидком азоте стока. В пилотных экспериментах мы использовали панель агаризованных сред (SM-агар, SM/2-агар, Maltose-HL5-агар) из перечня, рекомендованного ресурсом dictyBase.org. Наилучшие показатели роста были зафиксированы именно на среде SM-агар, где Dictyostelium демонстрировал заметный рост (формирование «бляшек» - участков бактериального газона, на которых Dictyostelium активно размножается, используя бактерий в качестве пищевого ресурса) уже на вторые сутки культивирования. Количество зон роста на SM-агаре также превышало таковое на других средах: 10-15 зон роста на 100 тыс. апплицированных клеток Dictyostelium через двое суток после посева против 2-3 на такое же количество клеток при культивировании на SM/2-агаре и Maltose-HL5-агаре. На втором этапе работы нам было необходимо отработать условия культивирования Dictyostelium в большом объёме безбактериальной жидкой среды для того, чтобы иметь возможность единовременно получить большое количество клеток (108-109) для основных HiC-экспериментов. Нами были опробованы среды с различным содержанием солей (гидро- и дигидрофосфатов натрия и калия), стандартных бактотриптонов и простых углеводов (глюкозы и мальтозы), однако ни один из вариантов среды не позволял получить стабильный рост Dictyostelium. Оптимальная среда была получена путём модификации среды HL5 c использованием высокопитательных смесей пептонов и переваров мяса с повышенным содержанием олигопептидов (Tryptose, LABM #MC008; Proteose Peptone A, LABM #MC011) с добавлением витаминного коктейля RPMI (Sigma #R7256). На полученной среде при стандартной температуре культивирования 22оС характерное время удвоения популяции клеток Dictyostelium составляет 24 часа. Перед проведением экспериментов по дифференцировке Dictyostelium мы выполнили HiC-эксперимент на популяции недифференцированных свободноживущих клеток, культивируемых в описанной выше модифицированной среде HL5 (HL5m). Изначально мы планировали использовать протокол HiC из лаборатории Д. Деккера, включающий стадии биотинилирования концов рестриктных фрагментов перед их религированием и последующей иммобилизации биотинилированных продуктов лигирования на магнитных шариках со стрептовидином. Однако впоследствии мы отказались от этого подхода в пользу альтернативной стратегии, предложенной в лаборатории Дж. Кавалли. Данная экспериментальная стратегия более проста в исполнении, поскольку не содержит этапа биотинилирования ДНК: после расщепления хроматина эндонуклеазой рестрикции (для повышения разрешения анализа, мы использовали частощепящую эндонуклеазы рестрикции MboI, сайт GATC) и лигирования «липких» концов ДНК полученная 3С-библиотека фрагментируется ультразвуком на короткие фрагменты (порядка 200-1000 п.н.), которые после репарации концов ДНК и лигирования адаптеров Illumina секвенируются парными ридами. Мы внесли ряд изменений в данную методику с тем, чтобы оптимизировать её именно для работы с Dictyostelium. В частности, мы изменили режим обработки ядер ионным детергентом (SDS) на этапе перед расщеплением хроматина эндонуклеазой рестрикции, поскольку в пилотных экспериментах столкнулись со значительной деградацией ДНК в образце эндогенными нуклеазами. Увеличение количества SDS в буфере на этапе, предшествующем рестрикции, до 1% позволило решить эту проблему. Мы провели HiC-эксперимент в двух независимых биологических повторах и на данный момент располагаем картой пространственной структуры хроматина свободноживущих клеток Dictyostelium, построенной с различными разрешениями, начиная с разрешения 5 т.п.н., которое по порядку величины совпадает со средним размером гена Dictyostelium (1,75 т.п.н.), что существенно для анализа топологии генома на высоком уровне детализации. Нами была отработана система дифференцировки Dictyostelium. Мы использовали два классических подхода: дифференцировка на нитроцеллюлозе и на КК2-агаре. Суть обоих подходов заключается в том, что вегетирующие (свободноживущие) клетки, находящиеся в лаг-фазе роста (плотность культуры в жидкой среде 2 – 4 млн/мл), помещаются в среду без пищевого субстрата (т.н. development buffer, DB – низкосолевой фосфатный буфер с магнием и кальцием) на твёрдую поверхность, после чего следует инкубация при 22оС в темноте в течение 18 – 24 часов. В случае дифференцировки на нитроцеллюлозе поверхностью служат нитроцеллюлозные фильтры, смоченные в DB; при дифференцировке на КК2-агаре клетки помещаются на поверхность свежего бактоагара, приготовленного на калий-фосфатном буфере. Дифференцировка на нитроцеллюлозе по неизвестным причинам прерывалась на стадии первичных клеточных агрегатов (streaming), поэтому мы остановились на способе дифференцировке на поверхности KK2-агара. Мы установили, что в создаваемых нами условиях наилучшие результаты достигаются при апплицировании 60 – 100 млн вегетирующих клеток на поверхность агара в стандартной 100-мм чашке Петри. Через 18 – 19 часов после старта дифференцировки наблюдается массовое и достаточно синхронное появление стадии «мексиканской шляпы» (Mexican hat), предшествующей формированию зрелых плодовых тел, которое происходит примерно на 23-м часу дифференцировки. На стадии «мексиканской шляпы» в составе зачатков плодовых тел уже присутствуют соматические и преспоровые клетки, поэтому именно эта стадия обычно используется, если исследование предполагает разделение двух клеточных типов. На данный момент нами отработан способ химической дезинтеграции клеточных агрегатов с использованием смеси хелатирующего агента (20 мМ EDTA), агента, восстанавливающего дисульфидные связи (12 мМ DTT), и протеазы (50 мкг/мл протеиназы К или 0,1% трипсина). На стадии оптимизации условий находится процесс разделения преспоровых и соматических клеток в непрерывном градиенте перколла. Мы выполнили два независимых биологических повтора HiC на свободноживущих клетках Dictyostelium discoideum (штамм AX4). HiC-библиотеки из каждого эксперимента были секвенированы парными ридами на Illumina HiSeq (около 100 млн парных ридов на библиотеку). Поскольку коэффициент корреляции двух образцов был 0,99, полногеномная карта пространственных контактов (хитмэп) была построена по данным, полученным после объединения двух биологических реплик, что позволило увеличить количество уникально картированных ридов, использованных для построения карты. В результате были построены карты пространственных контактов с разрешениями 5, 10 и 20 т.п.н. Первое наблюдение, которое следует из визуального анализа хитмэпа, заключается в том, что у Dictyostelium хромосомные территории выражены заметно слабее, чем у высших эукариот, особенно у млекопитающих. Возможно, это связано с тем, что геном Dictyostelium на два порядка меньше, чем, например, у человека, при том, что объем ядра клетки Dictyostelium и ядра клетки человека совпадают по порядку величины. Таким образом, можно предположить, что при прочих равных условиях, хроматин Dictyostelium имеет бóльшую подвижность, что выражается в меньшей степени компактизации его интерфазных хромосом по сравнению с хромосомами млекопитающих. Из анализа хитмэпа также следует, что 3’-конец хромосомы V и 5’-концы всех остальных пяти хромосом контактируют друг с другом и находятся в одном микрокомпартменте ядра, что подтверждает данные, ранее полученные с использованием техники флуоресцентной гибридизации in situ с зондами к повторам класса DIRS, расположенным на концах хромосом. Следует отметить, что неизвестно, где именно на хромосомах Dictyostelium расположены центромерные участки. Коллектив авторов, впервые опубликовавших полный сиквенс генома Dictyostelium discoideum и выполнивших его подробный биоинформатический анализ, придерживается мнения, что именно упомянутые выше элементы DIRS выполняют в Dictyostelium функцию центромер, что делает хромосомы этого организма телоцентрическими и позволяет интерпретировать кластеризацию концов хромосом как контакты их центромерных участков. В целом, схожая организация интерфазных хромосом характерна и для других исследованных эукариот. Так, в Schizosaccharomyces pombe наблюдается кластеризация теломер и центромер всех хромосом, а в Saccharomyces cerevisiae и Arabidopsis thaliana только центромеры хромосом кластеризуются друг с другом в пространстве ядра. Однако, ещё один участок кластеризации повторов DIRS в Dictyostelium располагается на 3`-конце протяжённой дупликации на хромосоме II, и по нашим данным он пространственно сближен с DIRS-содержащими концами остальных хромосом. Таким образом, возможно, хромосома II располагает двумя функциональными центромерными участками. Альтернативное объяснение этого факта заключается в том, что DIRS-обогащённые участки хромосом кластеризуются в одном микрокомпартменте ядра, что является частью механизма их стабильной репрессии, к примеру, с участием РНК-интерференции. Анализ пространственных контактов внутри хромосом алгоритмом Armatus не позволил на настоящий момент зафиксировать наличие у Dictyostelium регулярно расположенных топологически ассоциированных доменов (ТАДов), ранее обнаруженных на хромосомах человека, мыши, дрозофилы и делящихся дрожжей, и интерпретируемых как структурные единицы интерфазного хроматина. На данном этапе анализа мы не можем исключить возможность формирования в геноме Dictyostelium небольших глобул (размером 20 – 100 т.п.н.), присутствующих на всем протяжении хромосом. В некоторых местах генома границы между глобулами видны довольно отчетливо; другие, как правило, более длинные, фрагменты генома демонстрируют значительно более однородную организацию, тяготеющую, однако, к сворачиванию в протяженные компактные хроматиновые структуры без выраженных границ и с неясной внутренней структурой. Визуальный анализ хитмэпа однозначно свидетельствует в пользу отсутствия в Dictyostelium т.н. дальних контактов – пространственных взаимодействий элементов генома, разделенных большим расстоянием на молекуле ДНК. Таким контактам на картах пространственной структуры соответствуют зоны высокой интенсивности сигнала, расположенные вдали от диагонали карты. Как правило, такие контакты формируются между транскрипционными энхансерами и подконтрольными им промоторами, либо между функционально связанными коэкспрессируемыми генами. Отсутствие дальних контактов в геноме свободноживущих клеток Dictyostelium, судя по всему, свидетельствует о том, что (1) у этого организма энхансеры – если они имеются в большом количестве, как у других изученных эукариот – всегда располагаются поблизости от регулируемых ими промоторов (как у дрожжей, у которых, тем не менее, имеются дальние контакты между функционально связанными генами), и/или (2) коэкспрессируемые гены в Dictyostelium как правило расположены в одном геномном локусе, на небольшом расстоянии друг от друга вдоль цепи ДНК (релевантно и предположение, что коэкспрессия в Dictyostelium не требует образования пространственных комплексов коэкспрессируемых генов). В результате проведенного анализа была предложена принципиальная 3D-модель организации генома Dictyostelium в свободноживущих амебоидных клетках. Согласно этой модели, интерфазный хроматин Dictyostelium достаточно свободно располагается в ядре и имеет заметно меньшую степень компактизации, чем хроматин высших животных. Хотя вопрос о топологических доменах в геноме Dictyostelium пока остаётся открытым, на основе полученных данных мы можем утверждать, что на всём протяжении хромосом формируются умеренно конденсированные хроматиновые структуры, в некоторых местах генома интерпретируемые как топологически обособленные глобулярные домены. Важно отметить, что протяжённые участки хроматина Dictyostelium не демонстрируют тенденции к взаимодействию друг с другом в масштабе целой хромосомы, как это имеет место в клетках человека и мыши (т.н. А- и В-компартменты, образуемые взаимодействиями топологических доменов), и поэтому каждая отдельно взятая хромосома как целое представляется довольно неструктурированной. DIRS-обогащённые регионы хромосом располагаются в одном микрокомпартменте ядра, что является на данный момент единственным зафиксированным пространственным взаимодействием in trans.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Мы работали на нейрональных клетках личиночного происхождения линии BG3-c2. 5 млн клеток фиксировали 1% формальдегидом в буфере PBS, после чего лизировали в буфере с неионными детергентами, выделенные ядра пермеабилизировали SDS, хроматин обрабатывали эндонуклеазой рестрикции в течение ночи, после чего фрагменты хроматина лигировали с использованием стандартной Т4 ДНК-лигазы. После этапа лигирования ядра отмывали в буфере PBS, осадок замораживали в жидком азоте и хранили на -80С. Затем ядра изолировали в лунки 96-луночного планшета с использованием клеточного сортера. Этот этап процедуры занял довольно значительное время. Мы столкнулись с тем, что клеточный сортер потребовал крайне тщательной калибровки перед началом изоляции клеток, поскольку после стандартной процедуры калибровки подавляющее большинство ядер попадало не на дно лунки, а на её стенки. Такие ядра оказываются недоступны для последующих манипуляций. Успешно изолированные индивидуальные ядра были подвергнуты процедуре полногеномной изотермической амплификации (ПГА) ДНК с использованием полимеразы phi29, работающей по принципу «катящегося кольца» (набор реагентов Illustra GenomiPhi V2, GE Healthcare). Следует отметить, что данный подход к проведению Hi-C в единичных клетках был разработан нами совместно с коллегами из Австрии и США и использован в картировании топологии генома в ооцитах и зиготах мыши, результаты работы опубликованы в прошлом году в журнале Nature (Flyamer et al. 2017). В лунках, где ПГА прошла успешно, было получено от одного до пяти микрограмм ДНК. В общей сложности мы провели реакцию ПГА на 384 индивидуальных ядрах, при этом успешно реакция прошла на материале из 194 ядер. После ПГА ДНК фрагментировали ультразвуком до размера порядка 100-500 п.н., готовили библиотеки по стандартному протоколу для геномных библиотек Illumina и секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2000 с использованием 10-20 млн парных ридов на образец. К настоящему моменты секвенировано 102 библиотек и проведена их биоинформатическая обработка совместно с сотрудниками группы М.С. Гельфанда. Для обработки данных использовали пакет Distiller, в настоящее время активно разрабатываемый и внедряемый лабораторией Леонида Мирного (MIT, США). Данное программное обеспечение позволяет анализировать рид целиком (в отличие от стандартного подхода к обработке данных Hi-C, где используется итеративное картирование ридов). Обработка данных в Distiller включает следующие принципиальные этапы: 1. Картирование ридов на референсный геном. 2. Фильтрация не уникальных картирований. 3. Фильтрация ридов из очень коротких (<50 п.н.) и очень длинных (> 10 т.п.н.) рестриктных фрагментов. 4. Фильтрация пар ридов, в которых оба рида картируются на один и тот же рестриктный фрагмент. 5. Поиск химерных пар ридов. Химерной парой называется такая пара ридов, в которой либо оба рида целиком картируются в разные рестриктные фрагменты, либо по крайней мере один из ридов проходит через точку лигирования рестриктных фрагментов, определяемую по наличию сайта распознавания рестриктазы, использованной на этапе Hi-C проведения процедуры. Затем с использованием всего пула химерных пар ридов происходит аннотация партнёров по контактам для каждого рестриктного фрагмента. Поскольку мы используем диплоидные клетки, то для каждого рестриктного фрагмента теоретически может быть до 4 разных партнёров по контактам. Принимая во внимание то обстоятельство, что культивируемые клетки могут спонтанно менять плоидность, мы определили порог в 8 уникальных партнёров по контактам для каждого рестриктного фрагмента. Все рестриктные фрагменты с бОльшим количеством уникальных партнёров были отфильтрованы. Артефактные взаимодействия могут возникать в процессе полногеномной амплификации, поскольку известно, что полимераза phi29 способна осуществлять смену матрицы, тем самым строя искусственные «мостики» между разными молекулами в растворе и увеличивая наблюдаемое разнообразие уникальных продуктов лигирования каждого рестриктного фрагмента. 24 из 102 секвенированных библиотек из ядер, успешно прошедших процедуру ПГА, содержат более 10 тыс. уникальных контактов на геном. Это позволяет строить карты Hi-C с разрешением 10 т.п.н., что является вполне приемлемым для использования в процедуре Hi-Dam. Интересно, что судя по результатам даунсэмплинга, мы детектировали не все контакты в полученных библиотеках, и увеличение глубины секвенирования примерно вдвое должно повысить разнообразие детектированных пространственных взаимодействий в библиотеках из единичных ядер. Необходимо отметить, что само по себе получение карт пространственной организации хроматина в единичных клетках дрозофилы является серьёзным достижением, поскольку до сих пор данные такого рода в литературе отсутствуют. Хотя эти данные требуют глубокого биоинформатического анализа, который мы намерены провести в ближайшем будущем, уже сейчас можно сказать, что топологически-ассоциированные домены хроматина чётко различимы в индивидуальных клетках. На первом этапе проведённого биоинформатического анализа мы картировали ТАДы с использованием алгоритма Armatus в популяционных данных, в данных из единичных клеток, и в данных, полученных объединением ридов из индивидуальных клеток (пул). Полученные результаты свидетельствуют о том, что позиции ТАДов в индивидуальных клетках в высокой степени консервативны, и порядка 60% популяционных ТАДов могут быть обнаружены в одной отдельно взятой индивидуальной клетке. Затем мы провели анализ эпигенетических характеристик границ ТАДов, обнаруженных более чем в 50% клеток (т.н. конститутивных границ), и границ, встречающихся более редко (вариабельные границы). Оказалось, что конститутивные границы демонстрируют значительное обогащение метками активного хроматина (транскрипция, РНКП2, H3K27ac), в то время как вариабельные границы характеризуются гораздо более низкой представленностью активных меток. Таким образом, можно сделать вывод, что активные участки генома являются наиболее предпочтительными местами возникновения границ ТАДов. Эти данные подтверждают опубликованную нами ранее модель, в которой мы на основе анализа популяционных Hi-C карт дрозофилы делаем вывод, что именно активный хроматин является движущей силой возникновения границ ТАДов. На следующем этапе анализа мы аннотировали контакты поликомб-содержащих ТАДов в индивидуальных клетках. Главным результатом этого анализа является то, что дальние контакты таких ТАДов являются высоко вариабельными в клеточной популяции: в каждой индивидуальной клетке набор таких парных взаимодействий оказался разным. Это отражается вариабельность и стохастичность природы формирования поликомб-телец в клетках дрозофилы.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".