Механизмы выживания и гибели клетокНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Раздел 1. Проведенные прижизненные исследования (n=16) показали, что процесс энтоза в клетках культуры МСF7 занимает длительное время (до 72 ч). Внедрение клеток может происходить на стадии телофазы митотического деления. Так же внедряться могут предварительно ошарившиеся и частично открепившиеся от подложки клетки. Нами впервые было показано, что внедрение происходит в близлежащие клетки. Энтоз может заканчиваться деградацией поглощенной клетки и выбросом неперевариваемых остатков или выходом внедрившейся клетки. При этом вышедшая клетка может как успешно распластаться, так и погибнуть. Энтоз так же может закончиться гибелью энтозной клетки. Выход внедрившейся клетки является достаточно частым событием. Рапздел 2. Для исследования судьбы отдельных микроядер и микроядерной клетки в целом были проведены прижизненные исследования (24 ч) поведения клеток культуры MCF7 и А431 с множественными микроядрами (спонтанно-возникшими и индуцированными воздействием паклитаксела). В контроле было проанализировано 7 микроядерных клеток MCF7 и 3 микроядерные клетки А431. Так же были проанализированы 3 микроядерные клетки MCF7 и 2 микроядерные клетки А431 после воздействия паклитаксла (с последующей отмывкой агента). Проведенные прижизненные исследования показали, что клетки с микроядрами сохраняют жизнеспособность (не вступают в апоптоз) в течении 24 ч. При этом элиминация микроядер зарегистрирована не была. Для анализа особенностей строения микроядер методом трансмиссионной электронной микроскопии была проанализирована целостность ядерной оболочки, т.к. нарушения могут приводить к проблемам в микроядерно-цитоплазматическом транспорте. Методом иммуноцитохимического окрашивания были проведены исследования локализации ламина А и ламина В в микроядрах в клетках культуры MCF7 и начато исследование распределения ламина В в клетках культуры А431. Исследовали как спонтанно-образовавшиеся (одиночные), так и паклитаксел-индуцированные (множественные) микроядра. Анализ распределения ламинов показал, что спонтанно-образовавшиеся одиночные микроядра могут содержать ламины А и В в составе ядерной оболочки. Некоторые микроядра имеют частично нарушенную ядерную оболочку. Часть микроядер не окрашивается антителами к ламинам А и В. При исследовании множественных микроядер в одной клетки могут присутствовать как микроядра содержащие ламины А и В в составе ядерной оболочки, так и микроядра в которых ядерная оболочка нарушена в разной степени, вплоть до полного отсутствия ламинов. Такая разнородность может отражать степень деградации микроядер. Проникновение белка р53 в ядро приводит к активации транскрипции генов, блокирующих продвижение по клеточному циклу и проапоптотических генов. Было проведено исследование локализации белка р53 в микроядрах клеток культуры МСF7 (р53+). Показано, что только 16,25±2,3% одиночных микроядер окрашиваются антителами к белку р53. Большая часть спонтанно образовавшихся одиночных микроядер не окрашивается антителами к р53. При этом апоптотический индекс составляет не более 0,5%. Таким образом, наличие микроядер в клетках MCF7 может не вызывать остановку клеточного цикла и гибель клеток. В клетках с множественными микроядрами, образовавшимися при действии паклитаксела, р53 присутствует лишь в некоторых микроядрах в составе одной клетки. Избирательное окрашивание микроядер может быть связано с нарушением транспорта (нарушением строения ядерной оболочки). Кроме того, р53 может проникать в микроядра, содержащие двойные разрывы ДНК. В связи с этим начаты исследования ко-локализации белка р53 и ламина В, а также белка р53 и гистона гаммаН2Х, маркирующего двойные разрывы ДНК. Для анализа функциональной активности микроядер начато исследование возможности репликации ДНК в микроядрах клеток культуры А431 с помощью включения BrdU. В клетках культуры MCF7 включения BrdU в микроядра не происходит, т.к. эти клетки имеют активный белок р53, который вызывает остановку прохождения клеточного цикла в клетках с микроядрами. Раздел 3. Жизнеспособность клеток линий А431 и НаСаТ при действии СВЕ оценивали методом МТТ-теста. За 100% был принят контроль с добавлением спирта. Было установлено, что через 48 ч после инкубации с СВЕ статистически значимое снижение жизнеспособности клеток происходит при концентрации СВЕ 40 мкМ и выше. Так, при действии 40 мкМ СВЕ количество живых клеток снижается на 26%, при действии 60 мкМ – на 34%, при действии 100 мкМ – на 45%. В линии НаСаТ через 48 ч после начала инкубации с СВЕ значимое снижение жизнеспособности клеток – на 56% – происходит только при концентрации агента, равной 100 мкМ. Более низкие концентрации, такие как 20 мкМ, 40 мкМ и 60 мкМ, не вызывают статистически значимого эффекта. Таким образом, кератиноциты НаСаТ оказываются более устойчивыми к индукции гибели при действии СВЕ, чем клетки эпидермоидной карциномы А431. В клетках линий А431 и НаСаТ состояние грЭПР на светомикроскопическом уровне исследовали с помощью иммуноцитохимического выявления резидентных белков грЭПР с последовательностью KDEL. В то время как в контроле ЭПР имеет в них вид мелкой сетки, заполняющей практически весь объём цитоплазмы, после инкубации в присутствии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч в отдельных клетках иногда появляются окрашенные области, имеющие вид крупных кластеров. На ультраструктурном уровне при воздействии обнаруживаются как цистерны грЭПР, по структуре сходные с таковыми в контроле, так и претерпевающие различные изменения: так, могут появляться протяжённые участки, лишённые рибосом, а также возникать локальные расширения каналов ЭПР. Для визуализации аппарата Гольджи было проведено иммуноцитохимическое выявление матриксного белка p58K. При этом обнаружено, что в контроле аппарат Гольджи образует протяжённые области вблизи ядра клетки. В клетках, культивировавшихся в присутствии 40 мкМ СВЕ, аппарат Гольджи приобретает вид отдельных компактных кластеров, также, как правило, прилежащих к ядру. На ультраструктурном уровне при воздействии СВЕ в клетках А431 цистерны аппарата Гольджи значительно расширяются; при этом расширенными оказываются как цис-, так и медиальные и транс-части. Цистерны могут приобретать овальную форму, увеличивается размер окружающих везикул. При воздействии 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч в цитоплазме клеток А431 обнаруживается значительное увеличение числа и размеров цитоплазматических везикул кислого конпартмента. Кроме того, обнаруживается окрашивание цитоплазмы, которое может свидетельствовать об утечке красителя вследствие повреждения мембран. Значительное увеличение числа и размера везикул после инкубации клеток А431 в присутствии 40 мкМ СВЕ обнаруживается также на ультраструктурном уровне; среди них встречаются везикул, окружённые двойной мембраной. Такие везикулы представляют собой аутофагосомы. Аналогичные исследования были проведены в клетках линии НаСаТ. Результаты, полученные в данном случае, сходны с таковыми в линии А431, но имеют место при более высокой концентрации агента – 60 мкМ, в то время как при действии 40 мкМ картина практически не отличается от таковой в контроле. Для оценки роли стресса ЭПР в гибели клеток А431 и НаСаТ, а также исследования морфологических признаков стресса ЭПР, было проведено исследование действие на клетки дитиотреитола - восстанавливающего агента, который благодаря разрушению ддисульфидных связей нарушает сворачивание белков в полости грЭПР и таким образом индуцирует стресс. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста. Были протестированы концентрации ДТТ величиной 0,5 мМ, 1 мМ, 2 мМ и 4 мМ. По данным четырёх независимых экспериментов обнаружено, что по сравнению с контролем жизнеспособность клеток при данных концентрациях составляет 103 ± 5%, 100 ± 7 %, 87 ± 10% и 65 ± 19%, соответственно. В линии НаСаТ величина выживаемости при данных концентрациях составляет 93 ± 8%, 82 ± 9%, 65 ± 10% и 38 ± 7%, соответственно. Таким образом, клетки эпидермоидной карциномы человека оказываются более устойчивыми к действию данного агента, чем НаСаТ. Также было проведено предварительное исследование морфологии клеток на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. В линии А431 при концентрации 2 мМ ДТТнаблюдается значительное изменение морфологии клеток: они приобретают вытянутую, веретеновидную форму, цитоплазма их поджимается. При концентрации 1 мМ такие изменения выражены слабее и встречаются у относительно немногих клеток, а при действии 0,5 мМ картина практически не отличается от таковой в контроле. Сходная картина наблюдается и в линии НаСаТ. Раздел 4. Методом сканирующей микроскопии получены данные об изменении характера поверхности и активности мембраны в течение 6 часов постановки эксперимента на 3 сутки дифференцировки. На данном сроке большинство клеток (95-96%) в культуре ТНР-1 активно фагоцитируют, и состояние их плазматической мембраны находится в момент активного фагоцитоза, в части популяции наблюдается эффект после поглощения частиц. При фагоцитозе Fc-меченных частиц на поверхности плазматической мембраны клеток наблюдаются многочисленные выросты и формирование псевдоподий. Более 90% всей поверхности клеток активно. Размер выростов колеблется в диапазоне от 0,5 до 2 мкм. При этом псевдоподии могут достигать 3-4 мкм. Активная поверхность плазматической мембраны характерна для разных морфологических типов клеток: моноцитоподобных, макрофагоподобных «поляризованного» и «неполяризованного» типов. При фагоцитозе Man-частиц на поверхности плазматической мембраны не наблюдается активности. Плазматическая мембрана клеток формирует многочисленные складки, при этом выросты и псевдоподии отсутствуют. Наблюдается сглаживание поверхности клеток. Такое состояние мембраны показывает снижение фагоцитарной активности клеток на данном сроке, характерное для всех морфологических типов. При фагоцитозе Gel-частиц наблюдается различия в состоянии поверхности плазматической мембраны клеток. Доля клеток (50-60%) в популяции имеет многочисленные выросты и псевдоподии на мембране, что свидетельствует об активном состоянии мембраны. Встречаются в основном в макрофагоподобных клетках «неполяризованного» и «поляризованного» типов. При этом в популяции одновременно присутствуют клетки (примерно, 30-40%), мембрана которых сглажена. Это характерно для моноцитоподобного типа клеток и клеток с небольшими отростками. На мембране этих клеток отсутствуют выросты и псевдоподии, наблюдается формирование небольших складок, что свидетельствует о сниженном уровне их фагоцитарной активности. Для оценки влияния ЭЛС на фагоцитарную активность макрофагов в настоящем исследовании были использованы разные экспериментальные модели: 1) бронхо-алвеолярный лаваж (БАЛ) больных диссеминированным туберкулёзом. В исследовании были использован метод ТЭМ. Введение препарата ЭЛС в БАЛ больных диссеменированным туберкулёзом вызывает: снижение числа АМ(I) с 40% до 25%; активацию клеточной поверхности (появление многочисленных псевдоподий), фагоцитоз мембран PS; появление крупных фаголизосом в обеих субпопуляциях АМ. Раздел 5. Для выполнения поставленной задачи был использован комплексный набор методов. Для анализа морфологии клеток мы использовали световую микроскопию. Просвечивающую электронную микроскопию использовали для исследования ультраструктуры клеток и локализации поглощенных нанотрубок. Метод дифракции электронов был применен для детекции наночастиц в клетках и подтверждения их химическую природы. В эпителиальном слое желудка, тонкой и толстой кишки экспериментальных животных нами были выявлены локальные повреждения в виде нарушений эпителиального слоя: при окрашивании гематоксилин-эозином такие области имели вид светлых, рыхлых зон, располагающихся преимущественно в апикальной части ворсинок. Анализ ультраструктуры данных тканей с помощью электронной микроскопии показал, что в эпителиальном слое таких животных присутствовали группы клеток, находящихся на разных стадиях некротической гибели. Нами также наблюдались дистрофические изменения в печени: в области центральной вены цитоплазма гепатоцитов отличалась сильной неоднородностью окрашивания, содержала светлые зоны. Признаков воспалительного процесса в не выявлено. Исследование на полутонких срезах морфологии клеток показало, что в цитоплазме гепатоцитов присутствовали липидные капли размером 1-4 мкм и светлые вакуоли размером до 2-4 мкм. Гепатоциты были увеличены в размерах, также наблюдалась неоднородность цитоплазмы. Ультраструктурный анализ гепатоцитов показал зональное повышение встречаемости липидных включений неоднородной структуры, некоторые капли включали в себя зоны разной электронной плотности. Светлые вакуоли имели низкую электронную плотность, что свидетельствовало о гидратированном содержимом. Таким образом, выявленные ультраструктурные изменения в гепатоцитах указывают на развитие паренхиматозной дистрофии печени смешанного типа - жировой и гидропической. Нами не были выявлены накопления МУНТ в клетках и тканях исследованных органов. Таким образом, остается открытым вопрос, касающийся их проникновения через эпителиальный барьер тонкого кишечника, накопления или биодеградации в организме. В работе использовали МУНТ в составе промышленного материала «Таунит», а также МУНТ в составе промышленного материала «Деалтом». Оба наноматериала отличаются методами их промышленного получения, а также уровнем дефектности по углерод-углеродным связям («Деалтом» является менее дефектным). В качестве биологического окислителя использовали гипохлорит натрия в концентрациях 1 мМ и 100 мМ. Материал исследовали методами трансмиссионной и аналитической электронной микроскопии, а также использовали Рамановскую спектроскопию для выявления дефектов структуры. Модель макрофагального захвата МУНТ была отработана на клетках линии ТНР. Было установлено, что данный тип клеток способен захватывать кластеры нанотрубок и длительное время удерживать в фагосомах. На ультрастуктурном уровне наноматериал в фагосомах имеет высокую электронную плотность и хорошо выявляется. В ходе электронно-микроскопического исследования проинкубированных с гипохлоритом натрия (высокой и низкой концентраций) образцов, нами было продемонстрировано изменение внешнего вида обоих наноматериалов, выраженное в истончении стенок нанотрубок. Обработка гипохлоритом натрия в низкой концентрации привела к изменению внутреннего диаметра обоих наноматериалов в сторону его увеличения. При этом эффект высокой концентрации NaClO для двух типов нанотрубок оказался различным. Внутренний диаметр обработанных нанотрубок «Таунит» относительно контрольных увеличился, в то время как внешний диаметр при этом остался неизменным. Увеличения внутреннего диаметра наблюдались как локально, так и по всей длине нанотрубок. Нанотрубки «Диалтом» продемонстрировали повреждения стенок как с внутренней, так и с наружной стороны. Методом дифракции электронов было показано, что дифракционные кольца, характерные для МУНТ, остаются без изменений. Для подтверждения изменений в структуре МУНТ и оценки изменений количества дефектов, нами была использована Рамановская спектроскопия. Было установлено, что в ходе обработки обоих типов нанотрубок, количество структурных дефектов в них снижалось. Это позволяет сделать вывод, что гипохлорит натрия, окисляя поврежденные участки и разрушая их, способствует тому, что неповрежденными остаются графеновые слои с низким уровнем структурных дефектов. Для ответа на вопрос касательно деградации МУНТ в желудке, мы проинкубировали суспензию наноматериала «Таунит» с желудочным соком мыши. После инкубации основное количество МУНТ претерпело структурные изменения в виде повреждения внутренних и наружных стенок, или полного исчезновения трубчатой формы. При этом методом дифракции электронов были получены электронограммы, схожие с эталонными. Раздел 6. Клинический материал получен в ЦНИИ Туберкулёза. Для анализа выбран материал ткани лёгких с фиброзно-кавернозной формой туберкулёза (ФКТ). Для проведения сравнительного анализа забор материала производили из очагов некроза, разных участков перифокальной области и нормальной ткани. Для проведения ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) генов белков МЛУ каждый образец ткани замораживали в жидком азоте и размельчали в керамической ступке, затем там же гомогенизировали в 1 мл Tri-Reagent (MRC Inc., USA). Выделение тотальной РНК проводили в соответствии с протоколом производителя Tri Reagent. В области некроза тотальная РНК сильно разрушена в большинстве образцов, в связи с чем осуществлялся забор материала из области перифокальной зоны и нормальной лёгочной ткани. Результаты, полученные методом ОТ-ПЦР показали, что экспрессия белков МЛУ выявляется на достаточно высоком уровне во всех образцах и зонах анализа. Однако, применение метода РТ-ПЦР, который даёт более точные количественные данные, показало, что в операционном материале преобладает прежде всего экспрессия генов MDR1 и LRP, тогда как MRP1 и BCRP Определена линия мышей для изучения экспрессии генов белков МЛУ и предварительно проведён подбор праймеров и условий анализа экспрессии белков МЛУ в лёгочной ткани мышей. Для предварительного выбора модели проанализирован уровень экспрессии белков МЛУ в лёгких мышей различающихся уровнем чувствительности к заражению вирулентным штаммом M.tuberculosis. После оценки уровня экспрессии белков МЛУ сделан выбор в пользу линии BALB, так как мыши данной линии отличались наиболее низким уровнем экспрессии белков МЛУ в нормальной лёгочной ткани. Это означает, что при индукции активности этих белков можно с наибольшей степенью вероятности выявить увеличение экспрессии генов белков МЛУ. После заражения забой мышей проводился на следующие сроки эксперимента: 14, 28, 90 и 180 дней. Полученные методом ОТ-ПЦР результаты показали, что наиболее значимо возрастает экспрессия гена mdr1a; экспрессия гена bcrp практически не изменяется, гена lrp – варьирует и находится на низком уровне экспрессии для гена mrp1. Раздел 7. Однократное кратковременное (15 мин) световое воздействие слабым синим светом (λ440–470 нм, 1 дж/см2) на глаза очень старых (78-недельных) перепелов вызывает увеличение на 20% содержания митохондрий в клетках РПЭ без изменения их формы и ультраструктуры. Морфометрический анализ на электронномикроскопическом уровне хондриома рпэ японских перепелов разного возраста, содержащихся в условиях постоянного облучения синим (λ 440–470 нм), желтым (λ 530-560 нм) или обычным светом при сходной слабой дозе освещенности (1 дж/см2) показал, что при синем освещении численность митохондрий у птиц всех возрастов выше, чем в контрольных группах, особенно у молодых птиц (в 1,5 раза). При этом удельный объем митохондрий не изменился, т.е. они в целом более мелкие. Наряду с этим значительно повысилось количество и удельный объем видоизмененных мтх - кольцевидной и гантелевидной формы, особенно у молодых птиц ( в 2,5 раза и в 1,6 раза соответственно, у старых птиц – в 1,8 и 1,4 раза). Ранее мы показали (зак и др., 2014) повышение содержания таких митохондрий в рпэ как по мере старения, так и после сильного однократного освещения синим светом глаз интактных перепелов. Образование подобных митохондрий описано в разных культурах клеток в условиях метаболического стресса (liu, hajnoczky, 2011). Поскольку такие органеллы обладают увеличенной площадью поверхности, полагают, что повышение их числа отражает стресс-адаптивную реакцию клетки, обеспечивая более высокие уровни энергетического обмена (roehlecke et al, 2009; ahmad et al, 2013). Удельная площадь поверхности крист в митохондриях после синего освещения оказалась незначительно (на 10%) снижена в разных возрастных группах, в большей степени – у видоизменённых митохондрий молодых птиц (на 22 %). Поскольку количество митохондрий повышено гораздо значительнее, суммарный эффект изменений хондриома в клетках РПЭ - увеличение общей рабочей площади энергопродукции. Проведена оценка общей окислительной метаболической активности клеток рпэ взрослых перепелов (35-недельных) биохимическим методом путем инкубации суспензии свежевыделенных клеток с ресазурином. Установлено, что окислительная метаболическая активность клеток рпэ у птиц, содержавшихся при синем повседневном освещении, выше в1,5 раза по сравнению с птицами, выращенными при жёлтом свете. Для выявления апоптотических ядер в клетках рпэ проведен tunel-анализ срезов сетчатки перепелов разного возраста. установлено, что у молодых птиц (15-25 недель) апоптотические ядра отсутствуют, а у старых птиц (52-55 недель) составляют 7 % от всех ядер. после короткого (40 минут) мощного облучения синим светом апоптотические ядра появляются у молодых птиц в количестве 4 %. после повседневного низкодозового синего освещения птиц такие ядра у молодых птиц отсутствуют. у старых птиц количество апоптотических ядер при разных световых режимах достоверно не менялось. Для выявления «закрытых» хориокапилляров в собственной сосудистой оболочке (ссо) глаз японских перепелов разного возраста при повседневном действии синего света проведено гистохимическое исследование ссо с помощью α-gal/nac-gal-специфичного лектина maclura pomifera agglutinin (mpa), избирательно окрашивающего эндотелий японского перепела. морфометрический анализ показал, что при старении птиц доля открытых хориокапилляров постепенно повышается (на 40%). при повседневном синем освещении доля открытых хориокапилляров у молодых птиц значительно возрастает по сравнению с контрольной группой (в 1,5 раза), а у старых птиц снижается на 28% от контрольных значений. Для определения степени проницаемости хориокапилляров ссо проведен их морфомерический анализ на электронномикроскопическом уровне. установлено, что число фенестр в эндотелии хориокапилляров со стороны рпэ с возрастом увеличивается, несколько снижаясь после 36 недель, число трансэпителиальных каналов (тэк) в это же время снижается на 27%. Повседневное синее освещение приводит к повышению числа фенестр в 2 раза у молодых птиц, при этом численность тэк не меняется. в остальных возрастных группах различий нет. Выполнен анализ на световом и электронномикропическом уровнях миокарда правого и левого желудочков очень старых -78-недельных перепелов Coturnix japonica. На светооптическом уровне отмечено в обоих отделах визуальное увеличение доли соединительной ткани и диаметра кардиомиоцитов по сравнению с более молодыми перепелами, более извилистый ход мышечных волокон. На электронно-микроскопическом уровне выявлено, что ядра кардиомиоцитов левого и правого желудочков имеют, как правило, неровные, иногда сильно инвагинированные границы, что характерно для кардиомиоцитов птиц независимо от возраста. Миофибриллы формируют пучки разной толщины, нередко отмечались зоны их истончения и разволокнения, но их относительный объем соответствует уровню у молодых птиц (48-49%). Митохондрии гетерогенны по своей ультраструктуре, встречаются их удлиненные профили, что описано и в миокарде человека при ряде патологий и при старении. Их относительный объем не отличается от значения у молодых птиц (29%). Кольцевидные митохондрии, отмеченные ранее в правом предсердии птиц средней и старшей возрастных групп, встречаются в правом, но не в левом, желудочке уже у молодых птиц и не увеличиваются с возрастом. В отличие от более молодых птиц на данном сроке в обоих отделах наблюдаются в сравнительно равном количестве крупные липофусциновые гранулы и миелиноподобные тельца - возможно, признаки деградации митохондрий, а также значительное количество липидных гранул, более выраженное в правом отделе.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Получены следующие результаты. При исследовании возможности нарушения внедрения одной клетки в другую при энтозе с помощью наночастиц показано, что воздействие наночастицами диоксида титана в культуре клеток MCF-7 подавляет процесс энтоза за счет нарушения формирования адгезионных контактов. При исследовании поздних стадий энтоза в клетках культуры MCF-7 с помощью прижизненных наблюдений и окрашивания витальными лизотрекерами обнаружено, что после лизосом-опосредованной деградации внедрившейся клетки неперевариваемые остатки подвергаются экструзии. Изучение роли стресса ЭПР в процессе апоптотической гибели как нормальных, так и опухолевых клеток было исследовано путем индукции стресса ЭПР воздействием дитиотреитолом (ДТТ) и бортезомибом. ДТТ представляет собой восстанавливающий агент, нарушающий формирование дисульфидных связей при сворачивании белков в люмене ЭПР. Бортезомиб является ингибитором протеасом. Методами световой микроскопии в светлом поле, флуоресцентной микроскопии, МТТ-теста, проточной цитофлуориметрии, трансмиссионной электронной микроскопии, ПЦР в реальном времени и морфометрии продемонстрировано, что ДТТ вызывает дозозависимую индукцию апоптоза в линии клеток эпидермоидной карциномы человека А431 и нормальных кератиноцитов человека НаСаТ, что сопровождается изменением формы клеток и морфологии аппарата Гольджи, причём клетки А431 проявляют большую устойчивость к воздействию, чем НаСаТ. Также показано дозозависимое цитотоксическое действие бортезомиба по отношению к клеткам А431; эффект не исчезает после устранения агента из среды культивирования. Кадмий является очень токсичным тяжелым металлом, способным накапливаться в различных тканях и органах человека, в том числе в головном мозге, что может вызывать нейродегенеративные процессы. Используя культивированные нейроны мозжечка крыс, мы продемонстрировали, что присутствие 1-5 мкМ кадмия в среде культивирования нейронов в течении 48 часов вызывает интенсивную гибель этих клеток. Используя Fluo-4 AM -специфический флуоресцентный зонд для регистрации внутриклеточного свободного кальция было показано, что 24-х -часовая обработка культивированных нейронов кадмием вызывает интенсивное увеличение флуоресценции Fluo-4 в цитоплазме этих клеток, что соответствует повышению в их цитоплазме содержания ионов кальция. Этот эффект частично предотвращался 1 мМ ацетилцистеина (NAC) или 5 мкМ ионов марганца. Одним из цитогенетических признаков хромосомной нестабильности является присутствие в клетках микроядер. Для решения вопроса о том, какую роль играет наличие микроядер и их происхождение в выживании и гибели опухолевых клеток были исследованы культуры клеток карциномы кожи человека (А431) и карциномы молочной железы (MCF-7). Показано, что популяция спонтанно образовавшихся микроядер в клетках культур А431 и MCF-7 отличается гетерогенностью по строению ядерной оболочки, наличию двунитевых разрывов ДНК, способности к репликации и накоплению белка р53.Выживаемость и гибель клеток с микроядрами может зависить от особенностей строения и функциональной активности микроядер. Изучение реализации фагоцитарной функции макрофагов имеет важное фундаментальное и прикладное значение для понимания их роли в защитных реакциях и развитии патологических процессов. В представленной работе продемонстрирована пластичность фагоцитарной активности клеток ТНР-1 (острая моноцитарная лейкемия человека) в процессе прохождения ими разных этапов макрофагальной дифференцировки по провоспалительному типу активации (М1 макрофаги). В процессе дифференцировки общая фагоцитарная активность клеток существенно возрастает, и фагоцитоз реализуется преимущественно через Fc-рецепторы, характерные для М1-макрофагов. На 7-е сутки дифференцировки, наряду с высоким уровнем фагоцитоза Fc- и Gel-частиц, активируется поглощение Mаn-частиц через маннозные рецепторы, что свидетельствует о проявлении активации М2-макрофагов. Полученные данные позволяют сделать вывод, что реализация и пластичность фагоцитарной активности клеток выявляются на определенных стадиях дифференцировки и связаны с формированием функционально-зрелого морфологического фенотипа. Многостенные углеродные трубки (МУНТ) могут оказаться в клетках многоклеточного организма в результате техногенных процессов, либо при их применении в качестве носителей для лекарственных препаратов. Для решения вопроса о судьбе МУНТ, оказавшихся в клетках и тканях многоклеточного организма, была изучена деградация двух типов промышленных МУНТ со схожими параметрами (с изначально одинаково высоким уровнем дефектов и толщиной стенок) под действием периодических добавок 1 мМ или 100 мМ гипохлорита натрия в качестве биологического окислителя. В работе использованы методы трансмиссионной, сканирующей, аналитической электронной микроскопии, а также Рамановская спектроскопия и энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия. Показано, что оба типа промышленных МУНТ подвергаются деградации, но динамика и выраженность данного процесса сильно различаются. В настоящее время возможность активации механизмов лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам на уровне соматических клеток изучена недостаточно. Такая возможность существует прежде всего за счёт активации АТФ-связывающих белков-транспортёров, локализующихся на плазматической мембране соматических клеток разного происхождения и обеспечивающих формирование «множественной лекарственной устойчивости» (МЛУ). В работе проведён анализ экспрессии генов основных белков, отвечающих за развитие и формирование механизма МЛУ в клетках человека и показано, что в туберкуломах лёгких человека выявляется наиболее высокая экспрессия гена mdr1 - одного из основных генов МЛУ. Для решения вопроса о влиянии длительного действия синего света низкой интенсивности на клетки и ткани глаза в разных возрастных группах многоклеточных организмов проведен сравнительный морфометрический анализ на светооптическом и субмикроскопическом уровне возрастных изменений сетчатки у быстростареющих японских перепелов (Сoturnix japonica), используемых как модель человеческого глаза, содержавшихся при разных условиях освещения. Установлено, что повседневное действие низкодозового синего света ( коротковолновая часть спектра белой светодиодной лампы, λ440–470 нм), по сравнению с освещением, содержащим желтый спектр, вызывает в зоне глазного дна, а также в макулярной зоне разнохарактерные изменения толщины сетчатки, фотосенсорного слоя и размеров клеток (высоты тел и длины апикальных отростков) ретинального пигментного эпителия (РПЭ) - эти изменения наиболее выражены у молодых птиц. На тотальных препаратах РПЭ установлено уменьшение средней площади клеток у молодых и взрослых птиц в той же степени, что происходит у птиц старшего возраста, содержавшихся при желтом освещении. В фотосенсорном слое сетчатки у молодых и средневозрастных перепелов изменяется процентное содержание колбочек разной светочувствительности и соответствует этому показателю для старых птиц. На основе электронномикроскопического анализа численности субклеточных компонентов эндотелия хориокапилляров ССО (фенестр, трансэпителиальных каналов, межклеточных контактов, псевдоподий) и их распределения по разным сторонам капилляров установлено, что структурно-функциональная поляризация хориокапилляров на внутреннюю и внешнюю стороны с возрастом становится менее выраженной, а повседневное синее освещение приводит к более раннему и более значительному перераспределению структурных компонентов эндотелиальных клеток. Для получения полной картины возраст-зависимых процессов в сердце японского перепела (Сoturnix japonica), используемого как модельного объекта для изучения патологических и возрастных процессов в сердце млекопитающих и человека, проведено исследование клеточной гибели в миокарде желудочков юных неполовозрелых (возраст 6 недель) и старых перепелов (78 недель). Не выявлено методом TUNEL апоптотической гибели клеток в миокарде левого и правого желудочков юных птиц, однако у старых перепелов были единичные случаи апоптотических клеток. Такие данные согласуются с известными для сердца млекопитающих, что подтверждает возможность применения японского перепела как модельного объекта для возрастных процессов в сердце млекопитающих. Зон некрозов не выявлено в миокарде желудочков птиц всех возрастов. Также проведен ультраструктурный морфометрический анализ кардиомиоцитов желудочков 6-недельных (юных) перепелов. По сравнению с более старшими возрастными группами, на этом сроке в клетках миокарда в объеме цитоплазмы преобладают не миофибриллы, а митохондрии, что более выражено в правом желудочке. На основании этих и ранее полученных ультраструктурных данных можно заключить, что внутриклеточные признаки развития возрастных изменений весьма сходны в сердце птиц и млекопитающих.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Проблема сохранения жизнеспособности опухолевых клеток после воздействия химиотерапевтическими препаратами остаётся одной из наиболее актуальных проблем в области биологии опухолевых клеток и онкологии. Проведённое нами исследование показало, что после воздействия таким химиотерапевтическим препаратом, как паклитакселом до 65% клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека (MCF-7) сохраняют жизнеспособность в течение 7 сут. Воздействие паклитакселом с последующим удалением агента приводит к формированию популяции клеток с микроядрами, характеризующимися наличием повреждений ядерной оболочки, возникновением двунитевых разрывов ДНК, низкой пролиферативной активностью и активацией белка р53. Бортазомиб также является одним из наиболее применяемым в химиотерапии опухолей препаратом. В нашей работе обнаружено, что бортезомиб вызывает снижение жизнеспособности клеток как эпидермоидной карциномы А431, так и нормальных кератиноцитов НаСаТ; эффект при этом носит дозозависимый характер, а устойчивость обеих исследованных клеточных линий к воздействию данного агента примерно одинакова. После снятия воздействия снижение выживаемости клеток продолжилось. В обеих линиях бортезомиб вызывает повышение уровня экспрессии маркёров стресса ЭПР, таких как ATF4, CHOP и GRP78. На ультраструктурном уровне в клетках линии НаСаТ обнаруживается значительное расширение каналов ЭПР, а также изменение ультраструктуры митохондрий, несмотря на то, что выход цитохрома с обнаружен не был. При использовании ДТТ также наблюдается дозозависимый эффект, но при снятии воздействия жизнеспособность клеток может увеличиваться. Выход цитохрома с в процессе воздействия как бортазомибом, так и ДТТ на клетки НаСаТ не выявлен. Это свидетельствует об отсутствии участия митохондриального механизма в индукции апоптоза данными агентами. Таким образом, именно стресс ЭПР является механизмом запуска апоптоза при воздействии как бортезомибом, так и ДТТ в клетках НаСаТ и А431. Явление стресса ЭПР было обнаружено также при действии растительных гормонов. Показано, что все изученные растительные гормоны активируют гены стресса ЭПР, но последовательность активации генов через 24 часа воздействия - разная у нормальных и опухолевых клеток. Абсцизовая кислота (АБК) и гиберрелиновая кислота (ГК) оказывают разное влияние на компоненты секреторно-синтетической системы культивируемых клеток соединительнотканного происхождения. Мы предполагаем, что в дермальных фибробластах АБК вызывает активацию процессов, связанных с ЭПР-фагией, а в клетках фибросаркомы НТ1080 – с дифференцировкой клеток. ЖК стимулировала увеличение содержания аутофагосом в популяции клеток эпидермоидной карциномы А431 и не оказывала такого влияния на иммортализованную линию кератиноцитов НаСаТ. Появление аутофагосом может быть следствием стресса ЭПР и одним из признаков дифференцировки кератиноцитов. Судьба наноалмазов к клетках человека интересна как с позиций возможности применения этих наночастиц в качестве носителей лекарственных препартов, так и с позиций нанобезопасности. Полученные результаты свидетельствуют, что наноалмазы могут окисляться под действием биологически активных окислителей, которые образуются макрофагами. Это может иметь практическое применение в области биомедицинских исследований, так как свидетельствует о возможности деградации наноалмазов в макрофагах. Исследование механизмов выживания клеток при действии противотуберкулёзных препаратов проводилось с целью выявления роли белков множественной лекарственной устойчивости. В результате было обнаружено, что в лёгких экспериментальных животных не только выявляется экспрессия основных генов МЛУ при экспериментальном туберкулёзе, но и их экспрессия индуцируется при химиотерапии рифампицином. На культивированных клетках-зернах мозжечка крыс показано влияние ионов цинка на процесс гибели этих клеток, вызванной глутаматной токсичностью или окислительным стрессом. Продемонстрировано, что ионы цинка в нетоксических концентрациях способны повышать выживаемость нейронов при ряде негативных воздействий. Облучение синим светом в низких дозах (≤ 1 Дж/см2) оказывает фотобиомодуляционный эффект на клетки РПЭ старых птиц, стимулируя их метаболическую активность и активность их митохондрий посредством фотоактивации цитохром с оксидазы, а также повышая содержание митохондрий. Длительное освещение низкодозовым синим светом сказывается на состоянии мембраны Бруха, особенно у молодых птиц, что может привести к нарушению проницаемости гематоретинального барьера. Также оно способно изменять миграционную активность эндотелиальных клеток. Облучение синим светом в низких дозах (≤ 1 Дж/см2) оказывает фотобиомодуляционный эффект на клетки РПЭ старых птиц, стимулируя их метаболическую активность и активность их митохондрий посредством фотоактивации цитохром с оксидазы, а также повышая содержание митохондрий. Полученные данные по состоянию микроциркуляторного русла перепелов об отсутствии возраст-зависимых изменений в миокарде желудочков отличаются от имеющихся данных по миокарду млекопитающих при старении, указывая на границы применимости перепела как модельного объекта для изучения возрастных процессов в сердце млекопитающих и человека. Данные по ультраструктурным изменениям предсердных кардиомиоцитов указывают на гетерохронное развитие возрастных изменений в разных отделах сердца перепела, с более быстрым старением в секреторных кардиомиоцитах предсердий, выраженным уже у птиц среднего возраста. Однако в целом возрастные изменения предсердных кардиомиоцитов перепела совпадают с описанными для желудочковых, и с известными для миокарда млекопитающих, включая человека. Комплексное изучение структуры компонентов ядра и цитоплазмы клеток антиподальных комплексов зародышевых мешков пшеницы в ходе программируемой клеточной гибели показало, что уплотнение хроматина, разрывы ДНК, выявляемые методом TUNEL, выход цитохрома с из митохондрий, выявляемые при гибели антиподальных клеток оплодотворенных зародышевых мешков пшеницы, характерны для апоптоз-подобного типа клеточной гибели по классификации Reape and McCabe (Reape and McCabe, 2013). Разрушение тонопластов вакуолей и деградация органелл большей части антиподальных клеток неоплодотворенных зародышевых мешков, события аналогичные, происходящим при вакуолярной клеточной гибели (Van Doorn et al., 2011). Длительное воздействие 10мкМ латрункулина В в отсутствии сети актиновых филаментов нарушаются все системы микротрубочек интерфазных и митотических клеток. Веретено деления не формируется. Изменяется структура ядерной оболочки. Нарушается цитокинез.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа: Проведенное исследование показало, что для достижения различных целей можно применять различные криопротекторы: для первичных кератиноцитов использование РЕ10 и CS10 позволяет максимально быстро увеличить количество клеток, добавление LA к PE10 и CS10 может смещать баланс в сторону дифференцировки клеток. Данные, полученные при исследовании клеток с микроядрами, позволяют предположить, что в культуре НаСаТ спонтанно возникающие полиплоидные клетки вступают в патологический митоз, завершающийся образованием клеток с МЯ, которые элиминируются из популяции путем апоптотической гибели. Индуктор стресса ЭПР ДТТ и растительные гормоны АБК и ГК не вызывают снижение жизнеспособности дермальных фибробластов человека при 24-часовой инкубации в диапазоне концентраций от 0,5 до 4 мМ: исследуемые агенты не вызывают гибели клеток и не приводят к задержке прохождения клеток по клеточному циклу. При действии АБК и ГК наблюдается разная последовательность активации генов стресса ЭПР у дермальных фибробластов; и активация одного из генов дифференцировки происходит только при действии АБК. Полученные результаты показывают, что исследуемые РГ индуцируют стресс ЭПР в клетках НаСаТ и А431 по разному механизму, в частности, активация маркёра стресса ЭПР GRP78 после инкубации с ЖК наблюдалась только в иммортализованнх кератиноцитах, а после инкубации с ГК – только в клетках эпидермоидной карциномы. В то же время, ЖК стимулировала аутофагию только в клетках А431, а ГК – в обоих типах клеток. В культурах HaCaT и А431 воздействие индуктора стресса ЭПР ДТТ не вызывает изменений в структуре ЭПР ни на световом, ни на ультраструктурном уровне. Воздействие 75 нМ бортезомиба приводит к расширению каналов ЭПР, которое регистрируется только на ультраструктурном уровне и сохраняется после снятия воздействия в обеих культурах HaCaT и А431. 25 нМ бортезомиб вызывает обратимое расширение цистерн ЭПР только в культуре HaCaT. Воздействие 2 мМ ДТТ, 75 нМ и 25 нМ бортезомиба не приводит к изменениям в структуре аппарата Гольджи. Увеличение уровня экспрессии маркерных генов стресса ЭПР (GRP78, ATF4 и CHOP) при инкубации клеток HaCaT и А431 с 2 мМ ДТТ и с 75 нМ бортезомибом. Явление анастаза после снятия воздействия 2 мМ ДТТ и 25 нМ бортезомиба не обнаружено. Модельный коньюгат (ND-TCPP) образован наноалмазом (ND) и мезо-тетра(4-карбоксифенил)порфирином (TCPP). Показано, что отдельные наноалмазы-ТСРР имеют полигональную форму и размеры 4-7 нм. В макрофагах человека ND-ТСРР выявляются в виде электронно-плотного материала внутри многочисленных эндосом, размер которых варьирует от 200 нм до 3 мкм. При этом в структуре макрофагов не выявлено выраженных патологических изменений, что позволяет предположить, что присутствие данного вида наночастиц в отсутствии сенсибилизации не оказывает токсического действия на клетки человека. Наноалмазы без флуорохрома характеризуются увеличением содержания кислорода в 1,5 раза после их длительной инкубации (в течение 10 дней) с макрофагами ТНР-1. Это свидетельствует об окислении таких наночастиц внутриклеточными биологически-активными веществами макрофагов человека. При этом методы аналитической ТЭМ не позволяют провести анализ степени биодеградации наночастиц алмаза при их конъюгации с флуорохромом. Проведена оценка фагоцитарной активности клеток ТНР-1 на разных сроках макрофагальной дифференцировки (3 и 7 суток) и при разной длительности фагоцитарного процесса (3 и 6 часов инкубации). Оценка фагоцитарного индекса и интенсивности фагоцитоза проведена двум методами с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и проточной цитометрии с визуализацией. Предварительные данные показали, что оба метода дают сравнимые результаты анализа. Наибольшая фагоцитарная активность макрофагов регистрируется при рецепторном фагоцитозе латексных частиц с IgG, что свидетельствует о преобладании М1 пути активации макрофагов. Осуществлён подбор праймеров для анализа уровня экспрессии про- и противовоспалительных генов и генов множественной лекарственной устойчивости в макрофагах человека. Поставлены эксперименты на модели макрофагов человека линии ТНР-1 с применением разных латексных частиц для индукции конститутивного и разных вариантов рецепаторного фагоцитоза. Показано, что более дифференцированные нейроны, в условиях in vitro, более чувствительны к кадмиевой токсичности. Данные по возраст-зависимым изменениям в митохондриоме миокарда перепелов подтверждают ранее выявленное нами по другим параметрам гетерохронное развитие возрастных изменений в разных отделах сердца, с более быстрым старением в секреторных КМЦ предсердий птиц. В целом японский перепел может быть рекомендован в качестве модели ускоренного старения желудочков, но не предсердий, сердца млекопитающих. Введение ММСК-ПК человека снижает развитие деструктивных изменений миокарда сердца крыс в остром и хроническом постинфарктном периоде при индуцированном изопротеренолом инфаркте; более выраженный эффект имеют ММСК, культивируемые в 3D условиях. Мелатонин в зависимости от применяемой дозы оказывает негативное воздействие на морфологию и митотическую активность клеток культуры ARPE-19. Однако его действие в низких концентрациях обратимо и не изменяет потенциал-образующую способность хондриома. Непосредственное действие мелатонина на глаза японских перепелов вызывает смещение меланосом в клетках РПЭ и изменение в них доли митохондрий аномальной формы. На основании трехмерной реконструкции выделенных политенных хромосом антиподальных клеток, находящихся на разных стадиях онтогенеза, отдельных участков плеч политенных хромосом, и анализа их ультраструктуры, предложена модель структуры политенных хромосом растений. Разработана методика получения препаратов распластанных политенных хромосом растений.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Механизмы выживания и гибели клеток
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".