МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХНИР

.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ
Результаты этапа: Oксигенный фотосинтез, центральным элементом которого является фотосистема 2 (ФС2), – это не только основной продуцент органического вещества на планете, но и практически единственный источник молекулярного кислорода в атмосфере. Синтез О2 осуществляется каталитическим центром Mn4CaO5 кислород-выделяющего комплекса (КВК) ФС2 в процессе светоиндуцированного окисления двух молекул воды и является одной из важнейших биоэнергетических реакций. Однако, несмотря на значительные достижения в изучении структуры ФС2, механизм окисления воды остается во многом неясным. Проводимые нами исследования направлены на решение фундаментальной проблемы – выяснение механизма функционирования КВК и генерации молекулярного кислорода. В процессе работы с целью выяснения индивидуальной структурной и функциональной роли катионов марганца в окислении воды и с целью выяснения локализации участков связывания субстрата окисления нами были разработаны методы замещения катионов марганца в КВК на катионы железа. В результате были получены препараты ФС2, содержащие гетероядерные кластеры 3Mn1Fe, 2Mn2Fe и моноядерные кластеры 2Mn в каталитическом центре. Исследование функциональной активности полученных препаратов показало возможность окисления воды кластером 2Mn2Fe, но не до молекулярного кислорода, а до перекиси водорода. Особенный интерес представляют результаты, полученные при изучении кластеров 3Mn1Fe. Результаты экспериментов продемонстрировали возможность окисления данными кластерами воды до О2 (активность составляет около 30% от активности нативных препаратов ФС2). Полученные данные дают возможность предполагать, что в синтезе молекулярного кислорода участвуют только 3 катиона марганца (вместе с катионом кальция), тогда как четвертый катион марганца, возможно, оптимизирует данную реакцию, повышая её эффективность. Полученные результаты являются приоритетными и представляют интерес для фундаментальных исследований механизма катализа оксигенными организмами (растениями, водорослями, цианобактериями) синтеза молекулярного кислорода, а также для разработки альтернативных источников энергии, основанных на использовании фотосинтетических реакций. Исключительную важность дальних внутриклеточных взаимодействий в пространственной координации метаболизма, а также необходимость репарации мелких механических повреждений во избежание потери значительной части биомассы растения при гибели одиночных клеток определяют крупные размеры клеток харовых водорослей. Междоузлия Chara corallina удобны для изучения дальней внутриклеточной регуляции и защитных механизмов растительной клетки. В работе сочетали несколько методов: измерение модулированной флуоресценции хлорофилла на микроучастке клетки, микроэлектродные измерения внеклеточного рН (pHо), микроперфорация клеточной стенки с помощью стеклянных микроигл, регистрация концентрации О2 на поверхности клетки с помощью наноразмерных электрохимических датчиков, а также локальное освещение части клетки на заданном расстоянии от места измерения рНо, рО2 и флуоресценции. Показано, что микроперфорация клеточной стенки сопровождается повышением рНо и резким локальным снижением концентрации О2 у поверхности клетки. Прямое действие света и освещение участков, лежащих выше по течению цитоплазмы, приводило к возрастанию рНо в области микроукола, но не оказывало такого действия в контрольных условиях без повреждения. Результаты выявили влияние электрохимического градиента протонов на стимулируемый светом поток Н+ после микроукола. Полученные данные говорят также о том, что стимулирующее действие света опосредовано метаболитом, который попадает в цитоплазму из освещенных хлоропластов и поступает в зону повреждения путем диффузии и переноса с потоком цитоплазмы. Установлено, что дальняя передача внутриклеточных сообщений проявляется в изменениях флуоресценции хлорофилла, распространяющихся от места локального освещения в направлении потока цитоплазмы на расстояния до 5 мм. Прослежены фотоиндуцированные изменения окислительно-восстановительного состояния хлорофилла Р700 в мутантах цианобактерий, которые отличаются по редокс-состоянию пула пластохинонов в связи с нарушениями ряда оксидаз и дегидрогеназ. Результаты указывают на важную роль градиента протонов в регуляции фотосинтетического переноса электронов. Полученные сведения имеют теоретическое значение, т. к. расширяют представления об участии электрохимических мембранных процессов в регуляции фотосинтеза и защитных реакциях растительной клетки. Отработан оригинальный высокочувствительный метод регистрации транспорта кислорода через липидные монослойные мембраны с помощью созданного нами сканирующего электрохимического микроскопа (СЭХМ) с инвертированным платиновым кислородным электродом, смонтированного на ванне Ленгмюра. Этот метод позволяет исследовать влияние состава и структурной организации липидов мембран на их трансмембранное диффузионное сопротивление для кислорода. Установлены основные закономерности зависимости барьерных свойств мембран от состава липидов и их структурной организации. В качестве факторов, модифицирующих барьерные свойства липидных мембран, исследовали влияние разветвленных углеводородных цепей, включаемых в состав мембранобразующих липидов, а также многовалентных катионов, образующих комплексы с отрицательно заряженными группировками полярных головок липидов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в отсутствие канальных белков плотность упаковки липидов в мембранах является важнейшим параметром, определяющим проницаемость мембран для кислорода в нормальных физиологических условиях и при ряде патологических процессов.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ
Результаты этапа: В гигантских клетках харовых водорослей диффузия на расстояния 5–10 см крайне неэффективна и не может обеспечить дальние внутриклеточные взаимодействия. Диффузионные ограничения компенсируются непрерывным круговым переносом веществ с потоком цитоплазмы. Дистанционный механизм регуляции фотосинтеза и мембранных процессов при участии потока цитоплазмы проявляется по изменениям флуоресценции хлорофилла и локальным изменениям рН на поверхности клетки Chara в ответ на освещение участков, расположенных выше в потоке жидкости вдали от зоны измерения. В роли интермедиатов могут выступать экспортируемые из освещенных хлоропластов ассимиляты и восстановительные эквиваленты. На этапе 2017 года установлено, что передача сигнала, вызывающая переходное возрастание флуоресценции вдали места приложения фотостимула, выражена неравномерно в участках клетки, формирующих на свету зоны с высоким и низким наружным рН. Передача сигнала происходит эффективно в области кислых зон и сильно подавлена в области наружных щелочных зон. Эти различия проявлялись несмотря на равную квантовую эффективность фотосистемы 2 (ФС2) на слабом фоновом свету (10 мкЕ м–2 с–1). Предположено, что неравномерная передача сигнала в разных участках клетки определяется разным содержанием СО2 как субстрата фотосинтеза, но, главным образом, различиями рН цитоплазмы в области кислых и щелочных зон. Предложена математическая модель для описания изменений флуоресценции хлорофилла в ответ на локальное освещение удаленного участка клетки в зависимости от скорости течения цитоплазмы в период восстановления циклоза после его остановки в момент генерации потенциала действия, а также при замедлении течения в присутствии ингибитора актина (цитохалазин Д). С помощью рН-селективных и кислородных микросенсоров показано, что точечное повреждение клеточной стенки междоузлий Chara сопровождается резким локальным повышением наружного рН и поглощением O2 в области микроперфорации, причем поглощение О2 опережает сдвиги рН. Установлено, что сдвиги концентрации О2 и рН на поверхности клетки Chara при перфорации ослабляются после переключения фотосинтетического потока электронов с СО2-зависимого пути на восстановление О2. Опыты с применением метилвиологена и других ингибиторов говорят о том, что репарация повреждений клеточной стенки как важного защитного барьера клетки происходит при участии НАДФН оксидазы плазмалеммы. По измерениям поглощения хлорофилла Р700 реакционных центров фотосистемы 1 у дикого типа и мутантов цианобактерий Synechocystis PCC 6803 в норме и при действии ингибиторов установлена важная роль флавопротеинов Flv1 и Flv3, содержащих Fe–Fe кластер, в электрон-транспортных реакциях на стадии индукции фотосинтеза. ФС2 высших растений, водорослей и цианобактерий, используя энергию поглощаемого света, осуществляет окисление воды до молекулярного кислорода. Синтез О2 осуществляется каталитическим центром Mn4CaO5 кислород-выделяющего комплекса (КВК) ФС2 в процессе светоиндуцированного окисления двух молекул воды. Однако, несмотря на значительные достижения в изучении структуры ФС2, механизм окисления воды остается во многом неясным. Проводимые нами исследования направлены на выяснение механизма функционирования КВК и генерации молекулярного кислорода. С целью выяснения индивидуальной структурной и функциональной роли катионов марганца в окислении воды и определения локализации участков связывания субстрата окисления (молекул воды) нами разработаны методы частичного контролируемого замещения катионов марганца в КВК катионами железа и получены препараты ФС2, содержащие гетероядерные кластеры 3Mn1Fe в каталитическом центре. Продолжение исследований функциональной активности полученных препаратов на этапе 2017 года надежно показало возможность окисления воды химерным кластером 3Mn1Fe до молекулярного кислорода. Хотя скорость окисления воды этими препаратами существенно ниже активности нативных мембранных препаратов ФС2, важность этих данных не оставляет сомнений. Полученные результаты свидетельствуют, что для окисления воды и выделения молекулярного кислорода необходимо не 4 катиона марганца, а только 3, либо функцию 4-го катиона марганца может выполнять другой катион. Проведенные эксперименты подтвердили, что выделение О2 осуществляется именно химерным кластером, а не примесью препаратов ФС2 без кальция. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что катион железа в таком гетероядерном кластере связан с высокоаффинным марганец-связывающим участком. Помимо изложенных выше результатов в течение отчетного периода был исследован механизм взаимосвязи процесса инактивации КВК с процессом ингибирования электронного транспорта на акцепторной стороне ФС2. Нам впервые удалось показать, что замедление переноса электрона от первичного хинона Qa к вторичному хинону Qb при инактивации КВК определяется экстракцией не катиона кальция из КВК, а экстракцией периферических белков PsbQ и PsbP. Полученные результаты являются приоритетными и представляют интерес для фундаментальных исследований механизма синтеза молекулярного кислорода оксигенными организмами, а также в плане разработки искусственных фотосистем для технологического использования. С использованием метода сканирующей электрохимической микроскопии исследовано влияние химической природы (длины углеродного скелета, наличия боковых заместителей) и плотности упаковки липидов на барьерные свойства монослоев, сформированных на границе воздух/вода, по отношению к молекулярному кислороду. Для насыщенных неразветвленных длинноцепочечных спиртов и жирных кислот показано, что проницаемость монослоев для кислорода снижается с ростом длины углеродного скелета и с ростом поверхностного давления. Наличие боковых групп (нитроксильного фрагмента, метильных групп) в неполярной части липидной молекулы приводит к росту проницаемости монослоя для кислорода. Полученные результаты выходят за рамки гипотезы физиологической значимости транспорта кислорода через белковые «газовые каналы» и требуют дальнейших исследований в этой области.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ
Результаты этапа: Побеги харовых водорослей состоят из уникально крупных клеток междоузлий (~5 см), чередующихся с комплексами узловых клеток обычных размеров (~50 мкм). Гигантские размеры междоузлий этих водорослей определяют специфику жизненных стратегий и способов внутриклеточной регуляции. Представители Characeae приобрели особые механизмы дальних внутри- и межклеточных коммуникаций, т.к. диффузия в силу физических законов не может обеспечить быстрый перенос веществ на большие расстояния. Вместе с тем, харофиты физиологически и эволюционно близки к высшим растениям и совмещают такие важные свойства, как возбудимость, интенсивное течение цитоплазмы, фотосинтез, образование диссипативных структур (неоднородное распределение рН на поверхности клетки) и способность залечивать небольшие повреждения клеточной стенки. Все это делает клетки междоузлий Characeae уникальной моделью для исследования фундаментальных процессов растительной клетки. В настоящее время мало изучена роль непрерывного кругового движения цитоплазмы и светозависимого неоднородного распределения рН на поверхности клетки (pH banding) в регуляции фотосинтеза и в ответных реакциях на микроповреждения клеточной стенки. На этапе 2018 г. изучали изменения флуоресценции хлорофилла (F’), которые служат показателем дальнего транспорта фотометаболитов в потоке цитоплазмы. Эти изменения ярко проявляются в участках клетки с высокой активностью Н+-насоса плазмалеммы (области с наружным рН ~ 6.5, «кислые зоны») и резко ослаблены в участках с высокой Н+-проводимостью плазмалеммы (области с наружным рН ~10, «щелочные зоны»). Полученные результаты говорят о том, что малую амплитуду изменений флуоресценции F’ в области щелочных зон нельзя объяснить скудным содержанием в этих зонах углекислоты как субстрата фотосинтеза и, соответственно, недостаточным образованием в освещенных хлоропластах ассимилятов, которые экспортируются и распределяются по клетке с потоком цитоплазмы. Наиболее вероятной причиной представляется пониженный уровень рН цитоплазмы в области наружных щелочных зон, что замедляет работу ферментов, отвечающих за поступление фотометаболитов в затенённые «акцепторные» хлоропласты и за последующие редокс реакции с участием этих метаболитов. Таким образом, доставка метаболитов в акцепторные хлоропласты кардинально зависит от обмена Н+ между клеткой и средой. Изменения флуоресценции в ответ на удаленное локальное освещение были выражены наиболее четко при слабой фоновой подсветке всего междоузлия, а также проявлялись в измененной форме в течение 1–2 мин после выключения фонового освещения. Изменения флуоресценции при отсутствии фоновой подсветки подавлялись антимицином А, тогда как на фоновом свету этот ингибитор переноса электронов не оказывал влияния на изучаемые изменения флуоресценции F’. Сделан вывод, что поступление в строму фотометаболитов после их переноса с потоком цитоплазмы вызывает восстановление первичного хинонного акцептора ФСII QA посредством двух механизмов. Фотохимический механизм отражает избыточное восстановление хинонов фотосистемой II при недостатке конечных акцепторов электронов, а нефотохимический (темновой) путь опосредован антимицин-чувствительным переносом электронов от NADPH в пул пластохинонов. Синтез молекулярного О2 на планете осуществляется каталитическим центром Mn4CaO5 кислород-выделяющего комплекса (КВК), локализованного в ФС2 высших растений, водорослей и цианобактерий, в процессе светоиндуцированного окисления двух молекул воды. Несмотря на значительные достижения в изучении структуры ФС2, достигнутые в последнее время, механизм функционирования КВК остается во многом неясным. Проведенные нами в отчетном периоде исследования были направлены на выяснение механизма процесса окисления воды и генерации молекулярного кислорода в ФС2. Было продолжено изучение функциональной активности препаратов ФС2 с гетерогенным каталитическим кластером 3Mn1Fe, полученных на этапе 2017 года. Применение метода измерения кинетики индукции флуоресценции показало окисление воды химерным кластером. Продуктами окисления являются молекулярный кислород (около 30%) и перекись водорода. В комплексе экспериментов был проведен поиск метода получения препарата ФС2, содержащего кластер из трех катионов марганца. Подобный препарат представляет интерес для выяснения роли катионов железа в окислении воды кластером 3Mn1Fe. При исследовании взаимодействия катионов железа с ФС2 было обнаружено, что Fe(III) катионы, стабилизированные сахарозой (железо-сахарозный комплекс – ЖСК) значительно увеличивает скорость переноса электрона на акцепторной стороне ФС2 и эффективность этого влияния зависит от рН. Учитывая тот факт, что суспензия ЖСК является суспензией наночастиц и широко используется в фармакологии в качестве лекарства, применяемого при лечении анемии, полученные результаты могут представлять интерес для исследований, направленных на изучение эффективности подобных препаратов. С помощью предложенного нами метода, используя полученные сканирующим электрохимическим микроскопом (СЭХМ) зависимости тока инвертированного микроэлектрода от глубины его погружения под поверхностной мембраной, вычислены коэффициенты проницаемости монослойных мембран для кислорода. Найденные величины коэффициентов свидетельствуют, что в норме диффузионная подвижность молекулярного кислорода в липидном слое мембран на 2 – 3 порядка ниже, чем в водной фазе. Совокупность полученных результатов позволяет допустить, что резкое снижение барьерных свойств мембран эритроцитов для кислорода в микрокапиллярах происходит в результате падения величины поверхностного латерального давления (гидромеханическая регуляция натяжения).
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ
Результаты этапа: Движение цитоплазмы представляет одно из основных свойств растительной клетки, однако сведения о его функциональной роли крайне ограничены. В недавних работах с клетками междоузлий харовых водорослей установлено, что течение цитоплазмы участвует в механизмах дальней внутриклеточной регуляции фотосинтеза и трансмембранных потоков Н+. Поток цитоплазмы осуществляет передачу метаболических сигналов между участками, попадающими на яркий и слабый свет в условиях естественного флуктуирующего освещения. В работах кафедры биофизики биологического факультета МГУ недавно выявлены обратимые переходы в состоянии микрофлуидной транспортной системы. Переходы между проводящим и непроводящим состояниями происходят при образовании на свету особых клеточных участков с высоким наружным рН (щелочные зоны), а также при физиологическом сдвиге от фотосинтеза к темновому метаболизму. На этапе 2019 г. изучали возможные причины ослабления микрофлуидного транспорта в местах локализации наружных щелочных зон, а также роль течения цитоплазмы в передаче метаболитов от клетки к клетке по цитоплазматическим тяжам – плазмодесмам. Низкая эффективность дальней передачи сигналов устранялась при диссипации щелочных зон после генерации потенциала действия, а также при повышении рН цитоплазмы после добавления в среду ионов аммония. Полученные результаты говорят о том, что ослабление микрофлуидной передачи сигналов в области наружных щелочных зон обусловлено относительно низкими значениями рН цитоплазмы в этих зонах. Показано, что измерения флуоресценции хлорофилла на заданных расстояниях от области точечного освещения служат удобным неинвазивным подходом для анализа проводимости плазмодесм. Установлено, что плазмодесмы пропускают около 30% от общего количества метаболитов, экспортируемых из хлоропластов в поток жидкости в области освещения. Сделаны оценки коэффициента диффузии метаболитов внутри плазмодесм. Показано, что проводимость плазмодесм обратимо снижается при осмотическом стрессе. Найдено также, что пропускная способность плазмодесм проявляет чувствительность к внутриклеточной концентрации Са2+ и к ингибитору полимеризации актина, замедляющему течение цитоплазмы (цитохалазин D). Разработанный метод открывает новые возможности для изучения трансклеточного движения ассимилятов и динамических свойств плазмодесм. Другая часть исследований, проведенных нами в отчетном периоде, была направлена на выяснение механизма процесса окисления воды и генерации молекулярного кислорода в фотосистеме 2 (ФС2). Был изучен процесс взаимодействия наночастиц Fe(III) c ФС2. Обнаружено, что наночастицы в сочетании с некоторым альтернативными акцепторами электронов значительно ускоряют перенос электронов в ФС2. Установлено, что суспензия наночастиц неоднородна и состоит из двух частей, одна из которых может взаимодействовать с ФС2. Соотношение гетерогенных частей зависит от рН. Катионы Fe(III), входящие в состав наночастиц, не могут взаимодействовать с высокоаффинным (ВА) Mn-связывающим участком вследствие их низкой эффективности связывания по сравнению с константой связывания в наночастице. В соответствии с проведенным исследованием мы изучили взаимодействие с высокоаффинным Mn-связывающим участком трехвалентных катионов Tb3+ и La3+. Обнаружено, что в частицах ФС2 без марганца эти катионы связываются в темноте и необратимо с ВА участком. С этим участком связываются также трехвалентные катионы Al3+ и Cr3+. Связывание трехвалентных катионов с ВА участком приводит к его блокированию, т. е. к ингибированию донирования через этот участок электронов экзогенным донором. Полученные результаты подтверждены результатами измерения кинетики индукции флуоресценции в блокированных и неблокированных препаратах. Проведена оптимизация условий использования полярографического микрометода для измерения коэффициентов проницаемости для кислорода монослойных липидных мембран на границе раздела воздух/вода. Получены изотермы 'поверхностное давление – площадь' для монослоев из дифитаноилфосфатидилхолина. Из изотерм рассчитаны величины площади, приходящейся на липидную молекулу в монослое, и модуля сжимаемости. Измерены коэффициенты проницаемости для кислорода монослоев из дифитаноилфосфатидилхолина при различной плотности упаковки молекул липида. Установлена зависимость величины коэффициента проницаемости монослоя от поверхностного давления. По итогам этапа опубликовано 12 статей (из них 5 в высокорейтинговых журналах), 6 тезисов, с докладами на конференциях выступили 8 человек, 3 человека стали лауреатами премии по Программе развития МГУ.
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. МЕХАНИЗМЫ БИОЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ И ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы


Имя Описание Имя файла Размер Добавлен