Исследование структуры и функции белков иммунохимическими методами, биотехнологические аспектыНИР

Investigation of proteins structure and functions by immunological methods, biotechnological aspects.

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Исследование структуры и функции белков иммунохимическими методами, биотехнологические аспекты
Результаты этапа: С помощью модельных экспериментов были изучены процессы протеолитической деградации комплексов, состоящих из тропонинов I, Т и С. Продукты деградации были проанализированы с помощью моноклональных антител. В процессе работы сконструированы комплексы тропонинов I, T и С. Было получено два вида комплексов – собранные на основе рекомбинантных белков, а также комплекс, состоящий из белков нативного происхождения. Затем полученные препараты комплексов инкубировали в различных условиях в целях получения продуктов протеолитической деградации тропонина Т. В качестве среды инкубации использовали различные буферы, человеческие плазмы и сыворотку. Было отмечено, что в зависимости от среды инкубации электрофореграммы продуктов протеолитической деградации тропонина Т выглядят по-разному. В частности, показано, что в сыворотке тропонин Т быстрее подвергается протеолитической деградации, чем в гепариновой плазме. Было высказано предположение, что тропонин Т может подвергаться расщеплению с помощью тромбина. На следующем этапе работы продукты протеолитической деградациии тропонина Т были изучены с помощью ранее полученных в нашей лаборатории моноклональных антител. Были использованы методы Western Blotting, «sandwich»-иммуноанализ и иммунопреципитация. Кроме того, продукты протеолитической деградации были проанализированы с помощью высокожидкостной хроматографии на колонках с различными носителями. В процессе исследований было показано, что результатом протеолитической деградации тропонина Т является набор пептидов, обладающих различной молекулярной массой и электрофоретической подвижностью. Продукты протеолитической деградации тропонина Т протестированы с помощью более чем десяти пар моноклональных антител, взаимодействующих с различными эпитопами на поверхности молекулы тропонина Т. Таким образом, нами получены пары моноклональных антител, которые взаимодействуют как с интактной молекулой белка, так и с различными ее фрагментами. В результате исследований впервые было показано, что тропонин Т в сыворотке является мишенью для направленного протеолиза тромбином. Активация тромбина, вероятно, происходит в процессе отбора и приготовления проб для анализа. Это может быть важно для развития новых иммунохимических методов определения тропонина Т в крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Кроме того, было показано, что различные моноклональные антитела могут взаимодействовать с различными фрагментами тропонина Т в крови больного. Правильный выбор антител играет большую роль в полноценном определении содержания тропонина Т и его фрагментов в крови, что может быть основой адекватной постановки диагноза.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Исследование структуры и функции белков иммунохимическими методами, биотехнологические аспекты
Результаты этапа: В результате проведенных исследований было изучено воздействие аутоантител на определение концентрации тропонинов I и Т в крови больных с кардиологическими заболеваниями; также было показано наличие разнообразных форм тропонина Т в крови больных инфарктом миокарда. В процессе работы с использованием различных моноклональных антител было проведено определение концентрации тропонинов Т и I в образцах сыворотки и плазмы крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Было обнаружено, что при использовании для количественного определения тропонина Т антител с различной эпитопной специфичностью определяемая в одном и том же образце крови больного концентрация тропонина Т может сильно различаться. При более подробном анализе было показано, что в крови больных, по всей видимости, наряду с аутоантителами, негативно влияющими на количественное определение тропонина I, существуют также аутоантитела, мешающие определению тропонина Т. В дальнейших исследованиях с использованием моноклональных антител с различной как эпитопной (антитела, специфичные к одному белку), так и антигенной (моноклональные антитела, специфичные к тропонинам I, Т и С) специфичностью, было впервые обнаружено, что негативное влияние аутоантител на количественное определение тропонина Т наблюдается только в образцах, содержащих тропонин Т в виде тройного тропонинового комплекса, включающего все три тропонина - тропонины I, Tи С. Эти наблюдения были подтверждены в модельных экспериментах с использованием очищенного препарата тропонина Т (эндогенного и рекомбинантного) и тройных тропониновых комплексов (эндогенного и искусственного). Полученные данные позволили нам предположить, что эпитопы основной части аутоантител являются конформационными и сформированы фрагментами как минимум двух белков - тропонинов Т и I, а не отдельными субъединицами комплекса, как это считалось раньше. Также при исследовании образцов сыворотки и плазмы крови больных, собранных в разное время после начала сердечного приступа, было показано, что соотношение различных форм тропонина Т – фрагментов различного размера, свободного и в виде комплекса – может различаться в зависимости от времени взятия образца. В процессе исследований были разработаны методы дифференциального тестирования различных форм сердечного тропонина Т с использованием моноклональных антител. В работе были использованы модифицированные методы иммуноанализа типа «сэндвич» и иммунопреципитации; высокоэффективная жидкостная хроматография на колонках с различными носителями. В результате исследований впервые было показано, что в крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями содержатся аутоантитела, взаимодействующие с конформационными эпитопами, сформированными полипетидными цепями тропонинов I и Т. Показано, какие антитела (эпитопная специфичность) наиболее чувствительны к присутствию аутоантител в образце. Это знание представляется особенно ценным для правильного выбора моноклональных антител при создании нового поколения иммунохимических систем для количественного определения тропонинов I и Т в крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. В результате скрининга сывороток больных было показано, что содержание различных форм как индивидуальных тропонинов, так и всего тропонинового комплекса может различаться в зависимости от времени забора образца после начала заболевания. Это наблюдение также крайне важно для развития современных подходов в диагностике инфаркта миокарда.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Исследование структуры и функции белков иммунохимическими методами, биотехнологические аспекты
Результаты этапа: Были разработаны методики наиболее полного выделения эндогенных форм сердечных тропонинов из образцов сыворотки и плазмы больных инфарктом миокарда. С помощью нескольких пар полученных в нашей лаборатории моноклональных антител было показано, что в крови больных на ранних стадиях заболевания преобладают полноразмерный и частично деградированный тропониновый комплекс, а с течением заболевания степень протеолитической деградация компонентов тропонинового комплекса увеличивается, что приводит к диссоциации комплексных форм тропонина и смещения равновесия в сторону бинарного I-C комплекса и продуктов протеолитической деградации тропонина Т. Выяснение соотношения этих белков и их фрагментов может дать ключ к выбору моноклональных антител для создания достоверных систем для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование структуры и функции белков иммунохимическими методами, биотехнологические аспекты
Результаты этапа: В течение отчетного периода был проведен подбор моноклональных антител, специфичных к обеим скелетным изоформам тропонина I человека. Были подобраны пары антител, позволяющие достоверно определять в крови человека концентрацию ssTnI. Что касается определения концентрации fsTnI, то на данном этапе не было найдено систем, взаимодействущих только с этой изоформой скелетного тропонина I. Однако, были выбраны пары антител, взаимодействующие только со скелетными изоформами тропонина I, но не распознающие скелетный тропонин I, что делает возможным дифференциальное определение разных изоформ sTnI в крови больных. Также была определена эпитопная специфичность антител. Антитела были протестированы методом ИФА, вестерн-блоттинга, а также “сэндвич”- ФИА. С помощью выбранных пар антител были исследованы различные препараты sTnI. Было показано, что эти пары антител способны детектировать как свободный sTnI, так и sTnI в комплексе с TnC и TnT. Пара антител, специфичная к ssTnI, не обладала кросс-реактивностью с другими изоформами TnI. В итоге были проведены измерения концентрации эндогенного ssTnIв образцах сыворотки крови больных с травмами опорно-двигательного аппарата до и через различные временные промежутки после операции. Было показано, что концентрация ssTnI пропорциональна степени механического повреждения. Концентрация ssTnI возрастала после операции, достигала максимума через 20-28 ч, а далее снижалась. Таким образом, можно сделать заключение, что с помощью моноклональных антител к sTnI можно достоверно диагностировать наличие повреждения скелетных мышц.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".