Физико-химические основы молекулярной биоинженерииНИР

Physical and chemical bases of Molecular Bioengineering

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа: В 2016 году проведены детальные физико-химические и биологические исследования биомолекул, полимеров, нанобъектов, тканей, представляющих интерес для медицины и биотехнологии и определены дальнейшие научные и практические задачи Синтезированы нерастворимые, пористые полимерные материалы на основе полиэтиленимина и полилизина (сорбенты), предназначенные для эффективной сорбции фототрофных микроорганизмов в водных средах (водоемах, биоректорах). Ведется работа по созданию универсальных биогибридных композитных материалов (БКМ) состоящих из химических сорбентов - нетканых полимерных матриц с инкорпорированными в их волокна природными растительными структурами, являющимися местами активного заселения специфической аборигенной микрофлоры и/или с иммобилизованными углерод окисляющими микроорганизмами. Выделены активные штаммы микроорганизмов для биодеградации нефти и нефтепродуктов. В рамках работы по изучению взаимодействия пептидных блокаторов с гибридными каналами выполнен расчет структуры четырех новых мутантных форм блокатора калиевых каналов AgTx2, для которых была предположена повышенная селективность к каналу Kv1.3 по сравнению с мутантными формами, рассмотренными ранее. В рамках работы по изучению структуры и функционирования калиевых потенциалзависимых канало) проведена работа по улучшению ранее полученной пространственной модели канала Kv10.2. Проводилось изучение процессов фолдинга пептидов и тестовых пептидов и моделей мкромолекулярной цепи в вязкой среде. Проводилось изучение нуклеосом и их комплексов методами компьютерного моделирования, а также развитие интегративных подходов к моделированию, позволяющих комбинировать экспериментальные данные (электронная микроскопия, футпринтинг, FRET и т.д.). Исследованы взаимодействия белка Nwk с липосомами методом криоэлектронной микроскопии. Исследование связывание инактиватора арпина с Arp2/3 комплексом методом молекулярной динамики. Получена стабильная клеточная линия 293 FlpIn T-Rex, экспрессирующая TNKS1. Продолжены работы по исследованию процессов ремоделирования хроматина методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Разработаны новые методы моделирования функциональной динамики потенциалзависимых ионных каналов и оценки влияния мутаций белка на их функционирование. Разработаны: методика введения мутаций в белки человеческих потенциалзависимых калиевых каналов и методика моделирования функциональной динамики потенциалзависимых ионных каналов. Разработаны системы бактериального и бесклеточного получения фрагментов мембранных белков 1-го типа TLR3 и TLR4. Установлено, что резистентность клеток с пониженной чувствительностью можно преодолеть с помощью ингибиторов эндоцитоза. Были получены различные изоформы рекомбинантных иммуноглобулинов А к гемагглютинину вируса гриппа А. Были исследованы механизмы пероксидазной пермеабилизации липосом под воздействием комплексов цитохром с /кардиолипин и идентифицированы аминокислотные остатки цитохрома с, участвующие в процессе пермеабилизации. Были изучены физико-химические и биологические свойства белка человека Lypd6, участвующего в процессах эмбриогенеза. С целью создания новых препаратов для нейтрализации медиаторов воспаления и неоангиогенеза были созданы гибридные конструкции, включающие интегрин-связывающий вариант домена фибронектина 10Fn3 и ФНО-связывающий Z-домен белка А. Была проведена оптимизация условий экспрессии рекомбинантного бактериоопсина (Halobacterium salinarum) с мутацией в хромофорном центре (Y185F) в различных экспрессионных штаммах E.coli. Разработан новый молекулярный инструмент для исследования распределения и функций калиевых каналов. Для поиска и исследования лигандов канала Kv1.6 нами была разработана система, основанная на экспрессии гибридных каналов KcsA-Kv1.6 в мембране сферопластов E.coli и количественного флуоресцентного анализа образования комплексов токсин-канал. С использованием этой системы впервые было показано, что токсины скорпиона AgTx2, KTX-1 и OSK1 проявляют одинаково высокий уровень сродства к поровому участку Kv1.6, HtLx – низкоаффинный лиганд, а калиевые блокаторы MgTx и ScTx не связываются с порой канала Kv1.6. Был разработан оригинальный метод биосинтеза нового сополимера поли-3-оксибутирата (ПОБ) - поли-3-оксибитирата-со-3-окси-4-метилвалерата (ПОБВ), а также отработана технология получения других сополимеров ПОБ с использованием метода добавления предшественников для синтеза сополимеров штаммом-продуцентом Azotobacter chroococcum 7Б. С использованием полученных биоразлагаемых и биосовместимых поли-3-оксиалканоатов разработаны методы получения пористых матриксов и микросфер для инженерии костной ткани для челюстно-лицевой хирургии. Методом просвечивающей электронной микроскопии проанализированы везикулы, выделенные из клеток различных типов, а также из различных физиологических жидкостей. Показано, что везикулы, выделенные из раковых и нормальных клеток, имеют одинаковые размеры. Начаты работы по исследованию контактного ведения клеток на волокнистых субстратах. Контактное ведение проявляется в изменении формы клетки, растущей на ориентированном субстрате или субстрате, в котором присутствует механическое напряжение. Была разработана методика получения модельных матриц с точно позиционированным одноцепочечным разрывом с применением специальных ферментов (никаз), и получены ДНК-матрицы, содержащие уникально позиционированные разрывы не транскрибируемой цепи в +2, +7, +12, +17, +22 и +31 положениях нуклеосом-позиционирующей последовательности (NPS). Проводится исследование роли межнуклеосомных взаимодействий и N-концевых доменов гистонов в формировании нуклеосомного барьера и сохранении нуклеосом во время транскрипции с применением новых полинуклеосомных систем. Проводится работа по разработке тест-систем на основе мононуклеосомных матриц, для проведения скрининга для тестирования ингибиторов PARP-1. Разработана новая экспериментальная методика создания биоискусственных аналогов внеклеточного матрикса различных типов тканей, являющихся субстратом для адгезии, миграции и пролиферации тканеспецифичных и прогениторных клеток. Разработаны новые экспериментальные модели дефекта тощей кишки для оценки регенеративного потенциала различного типа скаффолдов. Изучена и доказана биосовместимость разработанных скаффолдов в экспериментах in vitro и их способность обеспечивать регенерацию в моделях полнослойной раны кожи мыши и моделях травмы тощей кишки крысы. Предложены нетрадиционные подходы к получению бислойных гибридных скаффолдов и производных скаффолдов в виде микроносителей для доставки клеток в область травмы
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа: В 2017 году получено 5 серий сорбентов (всего 24 сорбента) для сбора биомассаы фототрофных микроорганизмов. Синтезированные сорбенты могут быть рекомендованы для быстрой и эффективной сорбции клеток микроводорослей и цианобактерий из природных водных сред и в биотехнологии. Сорбирующая активность большинства из исследованных полимерных материалов значительно превосходит существующие на сегодняшний день аналоги. Проведены морфологическое, биохимическое и молекулярно-генетическое исследования зелёных микроводорослей из коллекции цианобактерий, водорослей и паразитов водорослей Санкт-Петербургского государственного университета (CALU), определено, что исследованные штаммы могут представлять биотехнологичский интерес в качестве продуцентов ценных полиненасыщенных жирных кислот, в особенности арахидоновой, линолевой и α-линоленовой. Исследования фотобактерий демонстрируют возможность их использования как тестовых объектов на токсичность новых материалов, используемых в очистке водных сред, и контроля за колонизацией материалов грамм-отрицательными бактериями. Проведено моделирование процессов фолдинга модельных полипептидов и развита теория коллективных конформационных движений. Методами компьютерного моделирования изучено влияние электромагнитного поля лазерного пинцета на конформации и динамику фоточувствительных белков с целью введения поправок при экспериментах по рассеянию лазерного рентгеновского излучения на единичных молекулах. Проведен анализ функционирования канала Kv7.1 методом расчета молекулярной динамики в липидном бислое, выявлены взаимодействия, оказывающие стабилизирующее влияние на конформацию канала. Методом расчета потенциала средней силы проведена оценка энергии связывания аджитоксина дикого типа и ряда его мутантов с каналом Kv1.1. Выявлена существенная корреляция с экспериментальными данными. Проведен первичный виртуальный скрининг низкомолекулярных лигандов канала Kv10.2 и получена сфокусированная библиотека лигандов. Проведен отбор потенциальных соединений-хитов для дальнейшего синтеза и тестирования in vitrо. Методами компьютерного моделирования проанализированы структура и конформационная динамика вне- и внутриклеточных доменов рецептора инсулина. В 2017 году проводили разработку методов интегративного анализа экспериментальных данных и моделирования нуклеосом. Разработана программа FRETTY, позволяющая анализировать данные FRET экспериментов. Был предложен и развит новый метод исследования ДНК, основанный на специфическом расщеплении сахарофосфатного остова ДНК под действием ультразвука. Получен изотопно-меченый вариант белка человека Lypd6, участвующего в процессах эмбриогенеза, определена его пространственная структура и динамика методами ЯМР-спектроскопии. Получен рекомбинантный пептидный блокатор калиевых каналов – хонготоксин (HgTx), на основе которого создан флуоресцентный зонд в виде химерного белка GFP-HgTx. Показано, что ингибиторы эндоцитоза, а также ингибитор образования актиновых филаментов цитохалазин Б блокируют вызываемую цитокином TRAIL интернализацию рецепторов смерти DR4 и DR5, в результате чего повышается чувствительность опухолевых клеток к TRAIL-опосредованному апоптозу. Разработаны протоколы получения трансмембранного и примембранного фрагментов рецептора TLR4. Проведены электронно-микроскопические исследования структуры ряда актинсвязывающих белков, потенциал-зависимых ионных каналов, комплексов РНК полимеразы с нуклеосомой и бактериофагов. На основе полученных данных предложены модели взаимодействия актинсвязывающих белков с актиновыми филаментами и лигандами. Исследованы свойства нового конъюгата бактериохлоринового фотосенсибилизатора со стирилнафталимидным производным (BChl–NI). Показано, что BChl–NI проникает в клетки аденокарциномы легкого человека А549 и накапливается в цитоплазме, формируя смешанное диффузно-гранулярное распределение. Возбуждение светом любого из двух хромофоров приводит в генерации в клетках активных форм кислорода и эффективной фотоиндуцированной гибели клеток, тогда как без активирующего воздействия светом конъюгат для клеток не токсичен. Появление флуоресценции стирилнафталимидного хромофора , которая исходно затушена вследствие резонансного переноса энергии, является индикатором фотоповреждения бактериохлоринового фотосенсибилизатора, и может быть использовано для оптимизации световых доз при фотодинамической терапии рака с применением этого конъюгата. В сотрудничестве с группой регуляции транскрипции и репликации была инициирована работа по исследованию влияния белковых факторов FACT и PARP-1 на конформацию флуоресцентно-меченных нуклеосом, а также начаты исследования по циклизации ДНК методами FRET и spFRET. В 2017 голу было проведено исследование гидролитической и ферментативной деградации (кинетики потери веса и молекулярной массы) поли-3-оксибутирата и его сополимеров: поли-3-оксибутирата-со-3-оксивалерата различного мономерного состава, поли-3-оксибутирата-со-4-метил-3-оксивалерата, поли-3-оксибутирата-со-полиэтиленгликоля и терполимера поли-3-оксибутирата-со-3-оксивалерата-со-полиэтиленгликоля в модельных условиях. Были исследованы рост и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на пористых матриксах из полученных поли-3-оксиалканоатов, показана спонтанная дифференцировка МСК в остеогенном направлении на полученных полимерных матриксах. Были разработаны методы культивирования МСК на пористых микросферах из полученных поли-3-оксиалканоатов. Были разработаны методы иммобилизации белкового фактора роста BMP-2 в пористых микросферах из полученных поли-3-оксиалканоатов. Реализована методика подготовки образцов внеклеточных везикул для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии с использованием иммуномечения. С ее помощью исследованы образцы внеклеточных везикул, выделенные из клеток MCF-7, проведено мечение белка CD9. Методом атомно-силовой микроскопии проведены исследования поверхности пленок на основе фиброина: чистого фиброина, его смеси с желатином, модифицированного фотоотверждаемого фиброина. Была продолжена работа над пошаговым описанием процесса транскрипции ДНК нуклеосом эукариот: а) методами футпринтинга определены структуры новых ключевых интермедиатов транскрипции хроматина; б) трёхмерные структуры комплексов нуклеосом с транскрибирующей РНК-полимеразой 2 с использованием методов ПЭМ и молекулярного моделирования. Детально проанализированы механизмы действия шаперона гистонов, белкового фактора FACT дрожжей, а именно: а) установлена его роль в элонгации транскрипции; б) определен механизм FACT-зависимого, АТФ-независимого разворачивания структуры нуклеосом. В 2017 году были продолжены исследования по созданию биорезорбируемых биополимерных скаффолдов, предназначенных для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине, и исследованию их биологических свойств. Также в рамках данной темы начаты экспериментальные исследования с применением аддитивных технологий – 3D-принтинга с использованием смеси полимеров – метакрилированного желатина и белков шелка: рекомбинантного аналога спидроина каркасной нити паутины Nephila clavipes и фиброина шелка из коконов тутового шелкопряда Bombyx mori. были получены фотоотверждаемые гидрогели на основе метакрилированного желатина и рекомбинантного спидроина и фотоотверждаемые гидрогели на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка, которые могут быть использованы при формировании скаффолдов для тканевой инженерии и раневых покрытий, в том числе микроструктурированных. Биосовместимые фотоотверждаемые производные спидроина были получены впервые. При выполнении исследований по указанной тематике использован широкий спектр классических и современных методов клеточной и молекулярной биологии, гистологии, световая микроскопия, в том числе конфокальная лазерная сканирующая, а также сканирующая электронная микроскопия.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа: В 2018 году проведены детальные физико-химические и биологические исследования биомолекул, полимеров, нанобъектов, тканей, представляющих интерес для медицины и биотехнологии и определены дальнейшие научные и практические задачи. В отчетном периоде был разработан новый подход к изучению запасов фосфора и азота на субклеточном уровне, потенциально применимый к различным типам клеток, способных накапливать включения, обогащенные азотом и фосфором. Продемонстрирована применимость предложенного метода как к клеткам эукариотических зеленых микроводорослей, так и к цианобактериям. Исследованы общие закономерности ультраструктурных проявлений фотоакклимации и фотоповреждения у фототрофых микроорганизмов, в том числе одноклеточных водорослей. Сформулирован парадокс сходимости для поверхности потенциальной энергии , представленной в виде суммы парных взаимодействий. Предложен способ описания взаимодействия между конформационными степенями свободы в пространстве торсионных углов через задание функций распределения для линейных комбинаций номеров гармоник и развит соответствующий математический аппарат. Разработаны биоинженерная технология получения четырех дисульфидных пептидных блокаторов калиевых каналов и система рекомбинантной продукции нейромодулятора человека lynx2. Сконструированы новые мутантные варианты лошадиного цитохрома с для изучения механизмов электронного транспорта в белковых соединениях. Получены генетические конструкты, содержащие регуляторные элементы и гены светочувствительных ретиналь-содержащих белков, для оптогенетических исследований. Для изучения мембранных белков методом ЯМР было проведено исследование различных свойства бицелл. Были найдены новые составы и показано, что определенные типы бицелл ничем не уступают таким широко используемым средам, как нанодиски и липосомы, в тоже время обладая очень важным преимуществом - маленький размер частиц. Исследованы структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Bnr1, Hof1, Abp1, TNKS1/2, Arp2/3-комплекса, а также белка промежуточных филаментов, виментина. Разработана модельная система для эффективного измерения модуля Юнга на противоположных концах мигрирующих фибробластов в культуре методом АСМ. Выдвинута гипотеза, что виментин отвечает за поляризацию клеток. Исследованы структуры вирусного шаперонина OBP. В исследованиях методом флуоресцентной микроскопии одиночных молекул установлено, что при физиологических концентрациях (100-200 мM) ионы K+ стабилизируют структуру нуклеосом в коровой области, тогда как ионы Na+ немного дестабилизируют ее. Выдвинута гипотеза, что из-за меньшего размера Na+ по сравнению с ионами K+, первый обладает повышенной способностью интерферировать с ионными взаимодействиями между ДНК и гистонами в областях входа/выхода ДНК в/из области ядра нуклеосомы и облегчает отворачивание ДНК от октамера гистонов. Был разработан способ биосинтеза бактериального альгината различными штаммами бактерий рода Azotobacter и проведено исследование физико-химических свойств полученного бактериального альгината в сравнении с водорослевым альгинатом. Исследована способность альгината и поли-3-оксибутирата к инкапсулированию биоактивного белка – защитного белка растений, выделенного из Pseudomonas fluorescens. Проведено комплексное исследование изменения физико-химических свойств (кристалличности, механики, гидрофильности) поли-3-оксибутирата и его сополимеров. В 2018 году работа лаборатории была сосредоточена на изучении контактного ориентирования – изменения формы эукариотических клеток при их культивировании на анизотропной подложке, имеющей выделенное направление. Контактное ориентирование проявляется в эмбриогенезе, при заживлении ран, развитии фиброзов и в других процессах. Разработаны новые междисциплинарные комплексные экспериментальные подходы для анализа структуры и динамики хроматина. С помощью разработанных методов детально описаны различные механизмы функционирования генома эукариот и транскрипции хроматина. Определена роль ряда факторов (коровых и линкерных гистонов, белкового про-опухолевого фактора FACT и некоторых последовательностей ДНК), влияющих на структуру и динамику хроматина. Кроме того, проведены исследования по изучению гибкости ДНК, фактора, который играет важную роль в процессах коммуникации в хроматине. Был создан и изучен искусственный межклеточный матрикс (ИММ), отличительной особенностью которого является наличие перфорированных стенок пор, с характерным микрорельефом, и представляющего собой аналог децеллюляризированного кожного лоскута
4 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа:
5 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа:
6 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Физико-химические основы молекулярной биоинженерии
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".