ИСТИНА

Использование материалов на основе белок-полимерных композиций является перспективным методом решения ряда проблем в области биотехнологии и медицины. Среди преимуществ дендримеров можно назвать точно контролируемые размеры и форму частиц, высокоупорядоченную трехмерную структуру с большим количеством поверхностных функциональных групп, а также наличие в структуре полостей и каналов, что предопределяет их способность образовывать комплексы «хозяин-гость» и взаимодействовать с гидрофобными сайтами белков. В нашей работе были получены нанопленки на основе пиридилфениленовых дендримеров 4 генерации с полностью пиридиновой периферией, содержащие белковый компонент. Для бета- и каппа-казеинов молока, альфа-лактальбумина, рекомбинантного овечьего приона и лизоцима была обнаружена способность встраиваться в самоорганизующиеся структуры толщиной около 400-700 нм. О включении белка в нанопленки свидетельствует исчезновение белка в растворе после инкубации с дендримером и образования нанопленок. Было обнаружено, что образование нанопленок зависит от соотношения белка и дендримера в исходном растворе. В работе были подобраны оптимальные условия для образования таких структур. Структура полученых нанопленок была исследована с помощью световой и атомно-силовой микроскопии. Полученные наноструктуры были проанализирована на стабильность, устойчивость к изменениям рН и действию детергентов. Было показано, что они стабильны по крайней мере в течении месяца, устойчивы к кипячению в растворе таких детергентов, как додецилсульфат натрия. Кроме того, протеолиз трипсином и пепсином вызывает лишь частичное разрушение нанопленок, а растворить их удалось только при нагревании в 2М соляной кислоте при температуре 65°С. Мы провели in silico молекулярное моделирование самоорганизации катионных пиридилфениленовых дендримеров с белками в регулярные наноструктуры и предложили возможную модель пространственной организации молекул. Мы полагаем, что полученные дендример-белковые системы перспективны с точки зрения возможного применения в области разработки новых биоматериалов, систем медицинского назначения и биосенсоров, обладающих высокой стабильностью.

The use of materials on the basis of protein-polymer compositions is a promising method for solving a number of problems in the field of biotechnology and medicine. Among the advantages of dendrimers can be called precisely controlled size and shape of the particles, highly ordered three-dimensional structure with a large number of surface functional groups, and the presence in the structure of cavities and channels, which determines their ability to form complexes "host-guest" and interact with the hydrophobic sites of proteins. In our work we were obtained on the basis nanoplenki piridilfenilenovyh generation 4 dendrimer with fully pyridine periphery comprising a protein component. For the beta- and kappa-casein milk, alpha-lactalbumin, recombinant ovine prion and lysozyme was found embedded in the self-organizing ability of the structure about 400-700 nm thick. About inclusion of protein in protein nanoplenki indicates the disappearance of the solution after incubation with the dendrimer and education Nanofilms. It was found that the formation of protein Nanofilms depends dendrimer ratio in the initial solution. In the optimal conditions were selected for the formation of such structures. The structure of the Nanofilms was studied by light and atomic force microscopy. The resulting nanostructures were analyzed for stability, resistance to changes in pH and the action of detergents. It was shown that they are stable at least for a month, are resistant to boiling in a solution of detergent such as sodium dodecyl sulfate. Furthermore, proteolysis of pepsin and trypsin causes only partial destruction Nanofilms and could only dissolve them with heating in 2M hydrochloric acid at a temperature of 65 ° C. We conducted in silico molecular modeling self piridilfenilenovyh cationic dendrimers with proteins in regular nanostructures and suggested a possible model of the spatial organization of molecules. We believe that the dendrimer-derived protein are promising systems in terms of possible use in the development of new biomaterials, medical devices and systems, biosensors with high stability.

Основным научным результатом проекта будет создание стабильных наноструктур, состоящих из пиридилфениленовых дендримеров и белков и исследование их свойств и биологической активности. С помощью данных микроскопии и молекулярного моделирования мы предполагаем предложить структурную модель организации дендример-белковых комплексов в нанопленки. Будет получена информация о стабильности полученных комплексов к агрессивным условиям, таким как действие детергентов, ферментов и изменениям рН среды. Эти данные составят основу для предложения конкретных вариантов применения новых биоматериалов: лекарственных средств на основе белков, в качестве биосенсоров, систем медицинского назначения, систем доставки лекарств, лабораторной диагностики. Поскольку мировой уровень исследований, проводимых участниками проекта, подтверждается публикацией основных результатов в ведущих отечественных и зарубежных изданиях, можно полагать, что результаты, полученные при реализации данного проекта, также будут носить приоритетный характер и соответствовать мировому уровню работ в данной области науки.

Фундаментальной задачей, на решение которой направлен проект, является изучение самоорганизации белок-дендримерных комплексов с целью получения биоактивных наноструктур c заданными параметрами. Нами были получены предварительные данные о способности пиридилфениленовых дендримеров к самопроизвольному образованию смешанных дендример-белковых ассоциатов регулярной структуры в форме пленок. Дендримеры представляют собой особый тип полимеров, обладающих монодисперсностью, точно регулируемыми размерами, постоянством формы, отсутствием зависимости поведения в растворе от свойств растворителя, температуры и pH среды. Мы изучали влияние дендримеров на разрушение прионных агрегатов и представили статью в журнал Macromolecular Bioscience, статья находится на рассмотрении после внесения поправок, предложенных рецензентами. В проекте предполагается изучить способность дендримеров к образованию стабильных наноструктур с белками, обладающими разными свойствами и биологической активностью, такими как казеины молока, амилодогенные белки, ферменты и антитела. Данные о структуре, свойствах и морфологии таких комплексов будут полезны для создания на их основе новых биоматериалов для применения в условиях мегаполисов, в том числе новых форм лекарственных средств на основе известных белковых препаратов, новых средств для повышения пероральной биодоступности лекарств, новых покрытий для биосенсоров и др.

В нашей работе были получены нанопленки на основе пиридилфениленовых дендримеров 4 генерации с полностью пиридиновой периферией, содержащие белковый компонент. Мы показали, что водорастворимые пиридилфениленовые дендримеры способны разрушать белковые агрегаты амилоидной природы на примере телец включения овечьего прионного белка. Налипание заряженных частиц дендримера на поверхность агрегата приводит к разрыхлению наружного слоя и последующему разрушению агрегата в результате отрыва комплекса белка с дендримером, переходящего в раствор. Для ряда белков (бета- и каппа-казеинов молока, альфа-лактальбумина, рекомбинантного овечьего приона, лизоцима, трипсина) была обнаружена способность встраиваться в самоорганизующиеся псевдо-двумерные структуры (нанопленки). О включении белка в нанопленки свидетельствует исчезновение белка в растворе после инкубации с дендримером и образования нанопленок, подтвержденное методом электрофореза и иммуноферментным анализом. Было обнаружено, что образование нанопленок зависит от соотношения белка и дендримера в исходном растворе. С помощью световой и атомно-силовой микроскопии было показано, что в зависимости от белкового компонента поверхностная структура пленки меняется. По данным атомно-силовой микроскопии толщина нанопленки, содержащей естественно неструктурированный каппа-казеин, составляет около 400 нм, а пленки со встроенным альфа-лактальбумином – около 700 нм. Полученные наноструктуры были проанализированы на стабильность, устойчивость к изменениям рН и действию детергентов. Было показано, что пленки стабильны по крайней мере в течении года в водном растворе при комнатной температуре, устойчивы к кипячению в растворе додецилсульфата натрия. Кроме того, протеолиз трипсином и пепсином вызывает лишь частичное разрушение нанопленок. Для полного растворения нанопленок необходимы достаточно жесткие условия: нагревание в соляной кислоте. Также был проведен детальный анализ взаимодействия катионных пиридилфениленовых дендримеров с прионным белком с помощью методов изотермической калориметрии титрования, динамического лазерного светорассеяния и определения изменений флуоресценции триптофана. Было показано, что используемые дендримеры способны выступать в качестве эффективных гасителей флуоресценции остатков триптофана. Было показано, что дендримеры и прионный белок образуют стабильные комплексы, которые не могут быть разделены ни при добавлении соли, ни под действием противоположно заряженных полимеров. Мы провели in silico молекулярное моделирование самоорганизации катионных пиридилфениленовых дендримеров с лизоцимом и показали, что дендример способен к образованию комплекса с лизоцимом, в котором пространственная структура лизоцима остается стабильной. Нами также были получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что трипсин способен проявлять биологическую активность в составе нанопленок. К сожалению, получить пленки с функционально активными антителами на данном этапе не удалось. Исследование цитотоксичности дендримеров выявило значительное увеличение выживаемости клеток при включении дендримеров в наноструктуры по сравнению со свободными дендримерами. Мы полагаем, что полученные дендример-белковые системы перспективны с точки зрения возможного применения в области разработки новых биоматериалов и систем медицинского назначения, обладающих высокой стабильностью. На основе проведенных исследований опубликована статья в международном журнале Macromolecular Bioscience, еще две статьи находятся на стадии опубликования, также выполнен устный доклад на V Съезде биохимиков России.