ИСТИНА

Рибосома является одной из основных мишеней антибиотиков в клетке. Данный проект направлен на разработку (дизайн) новых антибиотиков, действующих на Е-участок рибосомы. Через Е-участок во время транслокации рибосому покидает деацилированная тРНК. Блокирование Е-участка должно привести к остановке цикла работы рибосомы. Разработка новых антибиотиков именно к рибосоме облегчается тем, что в последние годы появились данные рентгеноструктурного анализа не только о структуре бактериальной рибосомы, но и эукариотической. Эти сведения позволяют проводить рациональный дизайн антибиотиков, которые будут обладать селективностью и, таким образом, смогут в перспективе стать основой для лекарственных препаратов. Работа по проекту состоит из трех этапов, которые, возможно, придется проходить многократно (итеративно). Во-первых, это дизайн новых соединений, потенциально способных взаимодействовать с Е-участком рибосомы на малой и большой субчастицах рибосомы. Во-вторых, это синтез запланированных соединений и, в-третьих, это тестирование способности синтезированных соединений ингибировать биосинтез белка in vitro и in vivo. Для создания лигандов для Е-участка малой субчастицы будут использованы структуры известных антибиотиков амикумацина, пактамицина и касугамицина. Разрабатываемые соединения будут содержать ароматическую систему, как пактамицин и амикумацин. Остальная часть молекулы потенциального гибридного антибиотика может быть взята из молекул амикумацина, пактамицина или касугамицина. Для придания специфичности антибиотик должен быть удлинен в сторону изобутильной группы амикумацина, чтобы создать стерические препятствия при связывании с эукариотической рибосомой. Именно в данной области в рибосоме эукариот находится петля рибосомного белка S14a. В создании потенциальных лигандов Е-участка рибосомы на большой субчастице мы планируем исходить из структуры комплекса рибосомы бактерий с тРНК. Мы полагаем, что можно создать соединение, по своей структуре напоминающее СА динуклеотид в той конформации, которая характерна для 3'-концевых нуклеотидов тРНК, связанной с бактериальной рибосомой.

Ribosome is one of the main antibiotic targets in the cell. The aim of the project is development of antibiotics targeting the E-site of bacterial ribosome. Through the E-site deacylated tRNA leaves the ribosome in the course of translocation. Occupation of the E-site by a small molecule would stop protein synthesis elongation. The aim seems feasible since the atomic structures are available for both bacterial and eukaryal ribosomes, which make possible a computer-based rational drug design approach. The project could be divided into three stages which might be applied iteratively. First is rational design of compounds, potentially able to interact with the E-site of the small or large ribosomal subunit. Second is synthesis of the designed chemicals and the third is testing of their ability to inhibit protein biosynthesis in vitro and in vivo. To create the ligands which would bind the E-site of the small ribosomal subunit we will use the structures of known antibiotics amicoumacin, pactamycin and kasugamycin. Designed compounds will have an aromatic system, similar to pactamycin and amicoumacin The rest of the hybrid antibiotic molecule would be combined from the side chains of antibiotics amicoumacin, pactamycin and kasugamycin. For increase of the antibiotics specificity we plan to introduce a bulky group at the side of amicoumacin isobutyl moiety aiming in creation of clashes with eukaryotic ribosome. In this side eukaryotic ribosome contain a loop of ribosomal protein S14a. To design potential ligands for the E-site of the large ribosomal subunit we will use an atomic structure of the tRNA complex with bacterial ribosome. We aim to create a compound mimicking the structure of CA dinucleotide in the conformation that could be observed in bacterial ribosome bound tRNA.

В результате выполнения проекта, на первом этапе будет сформирован виртуальный список соединений, потенциально взаимодействующих с Е-участком на малой и большой субчастицах рибосомы. Взаимодействие соединений из этого списка с рибосомой будет сначала моделироваться виртуально, с помощью программ молекулярной динамики, а затем, наиболее перспективные из них будут выбраны для органического синтеза. Синтезированные соединения будут проверены экспериментально на их способность взаимодействовать с рибосомой и ингибировать биосинтез белка у бактерий in vivo и in vitro. Селективность ингибиторов будет проверена с помощью линий клеток человека. В случае успеха, будет создана основа для дальнейшего усовершенствования ингибиторов рибосомы с перспективой создания антибиотиков, применимых в клинической практике.

Наш коллектив составляют специалисты в области исследования биосинтеза белка, в том числе и по поиску, синтезу и изучению новых антибиотиков, действующих на рибосому, специалисты в области молекулярного моделирования и методов компьютерной химии, химики – синтетики. В течении нескольких десятилетий исследуются молекулярные механизмы биосинтеза белка. Нашим коллективом было картировано расположение в бактериальной рибосоме мРНК, с помощью сайт направленного мутагенеза была исследована функциональная роль нескольких элементов рРНК, открыты шесть неизвестных ранее ферментов, модифицирующих рибосомную и транспортную РНК, изучена функциональная роль модификаций в процессе биосинтезе белка, разработан метод анализа белков, синтезированных рибосомой, и апробирован на модели ингибирования биосинтеза белка макролидным антибиотиком эритромицином. Для высокопроизводительного скрининга антибиотиков, ингибирующих трансляцию, создан специальный репортерный штамм, основанный на индукции гена флюоресцентного белка CER. С помощью этой системы скрининга и с использованием высокопроизводительной автоматизированной станции центра коллективного пользования НИИФХБ МГУ, среди культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов обнаружен ингибитор трансляции, выделенный в дальнейшем с помощью многоступенчатой хроматографии и идентифицированный с помощью масс-спектрометрии, амикумацин, известный ранее антибиотик, механизм действия и молекулярная мишень которого были неизвестны. Нам удалось выяснить, что этот антибиотик связывается с Е-участком малой субчастицы рибосомы и замедляет транслокацию. Совместно с исследователями из США были определены молекулярный механизм действия амикумацина и структура его комплекса с рибосомой бактерий. У сотрудников коллектива имеется опыт проведения исследований белок-лигандных взаимодействий in silico с использованием методов молекулярного докинга. Т

Для направленного создания ингибиторов биосинтеза белка были выбраны участки Е-сайта малой и большой субъединицы рибосомы. За основу создания производных, потенциально связывающихся с Е-участком малой субчастицы, рибосомы решено было взять антибиотик амикумацин. Участок Е-сайта большой субъединицы существенно различается у рибосом бактерий и эукариот. Мы решили создавать вещества, потенциально связывающиеся с этим участком рибосомы, на основе аденозина, содержащего дополнительные группы в том месте, где должен находиться предпоследний цитозин тРНК. Был составлен широкий список производных амикумацина, аденина и аденозина, имеющих в своём составе гетероциклические (пирролидиновые, имидазольные), фосфорсодержащие (фосфорильные, аминофосфорильные, аминобис(фосфорильные), (фосфорил)фенильные), диарилметановые, ацетальные и макроциклические фрагменты, а также фрагменты пространственно-затруднённых фенолов Выбор соединений был осуществлен также по результатам молекулярного докинга и молекулярно-динамического моделирования, основанного на поиске структур, обладающих высоким сродством к рибосоме. На первом этапе рационального дизайна лигандов индивидуально для амикумацинового и ССА-сайтов были сконструированы библиотеки из 20 гипотетических соединений, которые являются производными амикумацина и аденозина соответственно. Проведен виртуальный скриниг этих библиотек. На основании анализа результатов докинга для каждого сайта созданы библиотеки, содержащие по 115 синтетически доступных соединений, и проведен их виртуальный скрининг. На основании обобщенного анализа значений оценочной функций Grid score и результатов кластерного анализа отобраны соединения для синтеза. В результате проведённых исследований отработан метод многостадийного синтеза основных синтонов, использующихся для получения амикумацина С (т.н. «аминный» и «кислотный» фрагменты). При этом найдены оптимальные условия проведения ряда реакций, предложены новые синтоны для синтеза модифицированного амикумацина. Осуществлена поэтапная оптимизация метода синтеза антибиотика амикумацина С, обеспечивающего повышение выхода конечного продукта. Осуществлен синтез ряда новых производных аденина: фосфорсодержащие пуриновые основания; производные дифенилпропана, содержащие в своём составе фрагмент аденина, а также реакционноспособную аминоацетальную группу у С6 атома углерода; дибензоксантеновое производное; новые водорастворимые производные аденина: диэтил (2-(6-амино-9H-пурин-9-ил)алкил)фосфонаты и фосфоновая кислота и фосфониевая соль на их основе; дифосфорилированные производные. Разработан эффективный метод синтеза новых пуриновых оснований, модифицированных диарилпропановыми группами. Синтезированные соединения были протестированы на антибактериальную активность с помощью репортерного штамма pDualrep2 и в системе внеклеточного синтеза белка. К сожалению, среди синтезированных соединений не оказалось способных ингибировать биосинтез белка. Аналогичным образом было проведено тестирование соединения a8id30, для которого в результате виртуального скрининга было предсказано связывание с Е-сайтом бактериальной рибосомы, однако ингибирующая активность оказалась низкой. Можно предположить, что со свободной рибосомой данное соединение взаимодействует так, как предсказывает молекулярно динамическое моделирование, однако тРНК взаимодействует с E сайтом бактериальной рибосомы сильнее и вытесняет его. В то же время было определено, что 2-гуанидино хиназолины обладают способностью ингибировать перемещение рибосомы по мРНК. В двойной репортерной системе pDualrep2 был также проверен антибиотик мадумицина II, аланин-содержащий стрептограмина А, механизм действия которого до тех пор оставался неясен. Далее механизм действия мадумицина II был изучен при помощи системы бесклеточной трансляции, для определения стадии, на которой действует мадумицин, был использован метод тоупринтинга. При помощи рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.8 Å была проанализирована структура комплекса мадумицина с функционально активной 70S рибосомой Thermus thermophilus в присутствии мРНК и трех деацилированных тРНК в А-, Р- и Е-сайтах. Был обнаружен единственный сайт связывания антибиотика, располагающегося в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы. Оказалось, что мадумицин II останавливает рибосому на первом (инициаторном) кодоне. Полученные данные раскрыли новые детали механизма действия этого класса антибиотиков. Мадумицин II ингибирует работу рибосомы перед образованием первой пептидной связи, препятствуя правильному позиционированию А- и Р-сайтовых тРНК, в результате чего пептидная связь образоваться не может. Впервые обнаружена вызываемая связыванием стрептограмина перегруппировка нуклеотидов U2506 и U2585 23S рРНК, в результате которой образуется паря U2506-U2583, характерная для неактивного состояния пептидил трансферазного центра. Параллельно экспериментам по синтезу и изучению рибосомных антибиотиков, проводилось исследование бактериальных рибосом методами молекулярной динамики. Показано, что рибосомы, связавшие две тРНК в А- и Р- или же Р- и Е- сайтах, находятся в различных конформационных состояниях, которые глобально отличаются друг от друга взаимным расположением сотен оснований рРНК. Передача аллостерических сигналов в рибосоме осуществляется за счет изменения невалентных взаимодействий оснований нуклеотидных остатков рРНК; при этом легко перестраивающиеся участки рРНК перемежаются плотно упакованными стабильными элементами ее макромолекулы, что позволяет превращать микроизменения в макросмещения в структуре рибосомы. Найдены закономерности в конформационных изменениях 16S и 23S рРНК при связывании тРНК в Е-сайте. Эти результаты расширяют знания о механизмах регулирования работы рибосомы ингибиторами, а также способствуют дальнейшему улучшению молекул, имеющих потенциал быть использованными в медицинской практике