ИСТИНА

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) обнаруживают во многих нишах резидентных стволовых клеток. Функционирование МСК в нише часто является критичным для ее поддержания. В нише сперматогониальных стволовых клеток (ССК) также обнаружены клетки, похожие по свойствам на МСК. В секретоме МСК, содержащем широкий спектр факторов роста, цитокинов, компонентов внеклеточного матрикса, выявлены различные биоактивные молекулы, играющие важную роль в регуляции как морфологии, так и функции нескольких компонентов сперматогенной ниши, что позволяет предполагать вовлеченность МСК в регуляцию сперматогенеза. Однако функция МСК в нише ССК мало изучена. Фундаментальной научной задачей проекта является выяснение роли паракринных эффектов МСК в регуляции сперматогенной ниши. Впервые будет определено влияние секреторных компонентов МСК на поддержание функции как самих ССК, так и клеток, поддерживающих сперматогенез (клетки Сертоли, клетки Лейдига), включая оценку жизнеспособности, активацию пролиферации и сперматогенной дифференцировки клеток. На модели экспериментального крипторхизма у крыс будут выявлены ключевые клеточные компоненты, взаимодействие с которыми опосредует положительные эффекты секретома МСК на восстановление сперматогенеза. Результаты проекта позволят прояснить роль паракринных эффектов МСК в регуляции сперматогенной ниши и могут стать основой для создания эффективных лекарственных препаратов нового класса на основе продуктов секреции МСК для восстановления сперматогенеза.

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are found in many stem cell niches. Often, MSC function is critical for stem cell niche maintenance. One can find MSC-like cells also in spermatogonial stem cell (SSC) niche. Secretome of MSC contains wide spectrum of growth factors, cytokines and extracellular matrix components which can regulate morphology and function of several components of SSC niche. However, MSC function in the SSC niche remains poorly elucidated. To discover a role of MSC paracrine effects in the spermatogenic niche is a fundamental task of this project. We are going to be the first in defining the role of MSC secreted components in supporting SSC and subsidiary Sertoli and Leydig cells including increase of viability and proliferation and SSC differentiation. Pivotal components of SSC niche responsible for positive effects of MSC secretome on spermatogenesis restoration will be defined on the rat model of experimental cryptorchydism. Results of the project will clarify the role of MSC paracrine effects in spermatogenic niche regulation and would become a foundation for development of new effective MSC secretome-based drugs for spermatogenesis restoration.

Так как МСК поддерживают ниши стволовых клеток за счет паракринной регуляции поведения клеток микроокружения, ожидается увидеть эффекты секретома МСК на клетки сперматогенной ниши. Ранее на модели экспериментального крипторхизма мы обнаружили, что введение среды, содержащей секретом МСК, стимулирует пролиферацию клеток Лейдига и Сертоли в поврежденном яичке. Однако, предыдущие результаты ограничены морфологическими и гистологическими оценками. Поэтому в рамках данного проекта потенциальные мишени действия секретома МСК: ССК, клетки Лейдига и Сертоли, будут выявлены как морфологически, так и иммуногистохимически с помощью анализа специфических клеточных маркеров. Для окрашивания будут использованы антитела на специфические маркёры ССК и поддерживающих их клеток – PDGFRa, CYP11A1, GDNFRa и др. Оценка пролиферации будет проводиться с помощью анализа экспрессии маркёра пролиферации PCNA в ядрах клеток. Анализ стимуляции ангиогенеза в тканях яичка при введении секреторных компонентов МСК будет проведен с помощью окрашивания срезов на маркеры сосудов ( CD31). Кроме того, ожидается налаживание выделения и культивирования ССК, клеток Лейдига и клеток Сертоли из яичек мыши или крысы и получение результатов характеристики клеток по иммунофенотипу с помощью иммуноцитохимических методов для получения культур клеток, необходимых для выполнения задач второго года проекта. Таким образом, за первый год реализации проекта ожидается выявить основные механизмы эффектов МСК в отношении поддержания компонентов сперматогенной ниши, среди которых могут быть стимуляция пролиферации и выживаемости ССК, клеток Лейдига и Сертоли, а также поддержание пула ССК в канальцах. Данные предположения основаны на существующих данных, описывающих и подтверждающих функцию МСК в других нишах стволовых клеток, и на собственных данных, указывающих на значительный вклад секретома МСК в восстановление сперматогенеза на модели экспериментального крипторхизма у крыс

В ряде экспериментов было показано, что использование кондиционированной среды МСК, содержащей комбинацию секретируемых продуктов МСК, позволяет воспроизвести большинство терапевтических эффектов МСК. На основе этих данных в нашей лаборатории были созданы прототипы лекарственного препарата и биоматериалов для медицинских изделий для ранозаживления и регенерации тканей, содержащие продукты секреции МСК и характеризующиеся эффективностью, безопасностью и низкой иммуногенностью. Разработанные подходы были апробированы на образцах кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК, выделенных из жировой ткани нескольких десятков доноров, разработаны первичный и рабочий стандартный образцы и получены данные, необходимые для разработки нормативной документации и стандартизации лекарственных средств на основе продуктов секреции МСК-ЖТ человека. Апробированы методы оценки безопасности секретома, а также специфической активности на нескольких моделях in vitro и in vivo. Так, введение биоматериала, содержащего секретом МСК, под белочную оболочку яичка приводило к уменьшению выраженности гипотрофии крипторхированных яичек, оказывало выраженное стимулирующее действие на сперматогенез, повышая общее количество сперматозоидов и их подвижную фракцию. Путем гистологического анализа были выявлены нормализация процессов сперматогенной дифференцировки и снижение количества склерозированных/атрофических семенных канальцев, а также восстановление пула клеток Сертоли и Лейдига при введении комбинированного биоматериала, по сравнению с животными, не подвергавшимся терапии. Введение биоматериала, содержащего концентрат секретированных МСК продуктов, оказало выраженное воздействие на восстановление сперматогенеза, сравнимое с результатами введения самих МСК ЖТ под белочную оболочку яичка.