ИСТИНА

Проект основан на совершенно новой для современной науки гипотезе о наличие рецептора липопротеидов низкой плотности (ЛНП) Т-кадгерина на мембране тромбоцитов, который запускает быструю внутриклеточную сигнализацию. Благодаря использованию ряда современных подходов в результате проекта будет идентифицирован неизвестный ранее гликозилфосфатидилинозит-заякоренный белок и описана тромбоцитарная изоформа Т-кадгерина. Полученные данные позволят понять роль ЛНП-индуцируемых сигнальных каскадов в развитии атеросклероза и атеротромбоза, что имеет теоретическое и прикладное значение.

The project is based on a completely new hypothesis about the presence of the T-cadherin as a low-density lipoprotein (LDL) platelet receptor, which triggers rapid intracellular signaling. Using a number of modern approaches, the study will identify the previously unknown glycosylphosphatidylinositol-anchored protein and describe the platelet isoform of T-cadherin. The obtained data will allow to understand the role of LDL-induced signaling in the development of atherosclerosis and atherothrombosis, which has theoretical and applied significance.

1) Отработка методики выделения мембранных рафтов тромбоцитов и ГФИ-заякоренных белков из них, определение молекулярных масс всех ГФИ-белков тромбоцитов в полиакриамидном геле. Проведение пробных экспериментов по масс-спектрометрическому анализу. 2) Подбор праймеров к большинству экзонов CDH13 для однозначной идентификации сплайс-вариантов при сравнении с описанными в базах данных. Проверка праймеров на положительном контроле (эндотелиальные или гладкомышечные клетки).

Помимо огромного задела в этой области у нашего научного коллектива, который был заложен в 90е годы в Научно-исследовательским Институте экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра под руководством В.А. Ткачука, у нашей молодой профессиональной научной группы есть целый ряд положительных результатов. Для обнаружения Т–кадгерина на тромбоцитах мы использовали 4 разных антитела, что позволило нам определить, что только антитела, полученные против полноразмерного Т-кадгерина, демонстрируют крайне специфическое связывание с тромбоцитами. Наши данные доказывают, что на тромбоцитах есть ГФИ-заякоренный белок с эпитопами Т-кадгерина, поскольку после обработки PI-PLC связывание антител значительно уменьшается. Анализ молекулярной массы Т-кадгерина на тромбоцитах методом иммуноблоттинга показал, что она значительно отличается от его массы в ядерных клетках: 3 коммерческих антитела (вкл. моноклональные) окрашивали полосу массой около 200 кДа, тогда как масса Т-кадгерина в других клетках 105 и 130 кДа. Некоторые антитела дополнительно окрашивают полосу в 45 кДа, наблюдаемую и другими исследователями. Нами разработан оригинальный метод коиммунопреципитации Т-кадгерина, который мы планируем применить в настоящем проекте на лизатах тромбоцитов. Основными местами выполнения работы будет лаборатория генных и клеточных технологий ФФМ и учебно-научный центр коллективного пользования на базе МНОЦ МГУ, где есть помещения и оборудование для проведения биохимических, биофизических, молекулярно-биолигических и клеточных исследований. Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) образцов планируется проводить на базе ИБХФ РАН в лаборатории масс-спектрометрии биомакромолекул на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra . Достижимость запланированных результатов будет обеспечена молодым профессиональным коллективом, имеющим опыт работы в области биофизики, биохимии, молекулярной биологии, цитологии и кардиологии.

1) Отработана методика выделения мемранных рафтов тромбоцитов в градиенте сахарозы методом ультрацентрифугирования. Проанализированы ГФИ-заякоренные белки тромбоцитов, высвобождаемые после обработки тромбоцитов фосфолипазой С(PI-PLC). Проведен масс-спектрометрический анализ образцов из полиакриламидного геля. 2) Подобраны и протестированы праймеры к экзонам CDH13, что позволило однозначно идентифицировать изоформу 1 (identifier: P55290-1 по UniProt).