ИСТИНА

С внедрением высокоэффективных антиретровирусных препаратов в рамках новых терапевтических протоколов (HAART) возникновение В-зрелоклеточных лимфом, как побочного заболевания при ВИЧ и частой причины смерти ВИЧ-инфицированных пациентов, приобретает особенно важное значение (Bibas & Antinori 2009; Han et al. 2016). Наиболее распространенными ВИЧ-ассоциированными лимфомами являются лимфома Беркитта, диффузная B-крупноклеточная лимфома (ДБККЛ) и другие агрессивные не-Ходжкинские лимфомы (Gopal et al., 2013). Все они происходят из В-клеток, хотя В-клетки непосредственно не заражаются ВИЧ. Таким образом, механизмы малигнизации при ВИЧ-опосредованном В-лимфомагенезе до конца не ясны и делают актуальным предлагаемый проект. Предполагаемым ВИЧ-ассоциированным индуктором онкогенеза является вирусный (14 кДa) Tat-белок (trans-activator of transcription). Tat-белок запускает транскрипцию вирусных генов (Van Lint et al., 2013) и регулирует различные процессы в клетке хозяина, непосредственно связываясь с ядерными сруктурами (Romani et al., 2010). Tat-белок может выходить из инфицированных клеток и на высоком уровне детектируется в плазме кроме ВИЧ-инфицированных пациентов (Westendorp et al., 1995) даже при проведении антиретровирусной терапии (Mediouni et al., 2012). Tat-белок, продуцируемый инфицированными клетками, может проникать в неинфицированные клетки, включая В-лимфоциты (обзор Musinova et al., 2016). В результате В-клетки ВИЧ-инфицированных пациентов являются Tat-положительными и ВИЧ-отрицательными (Frankel & Pabo, 1988; обзор: Musinova et al., 2016). Как было показано на трансгенных мышах, это может индуцировать В-клеточный лимфомагенез (Kundu et al., 1999). Возможные механизны ВИЧ-опосредованного В-лимфомагенеза включают несколько факторов. Во-первых, Tat-белок, покидая инфицированные клетки, способен неспецифически связываться с рецепторами цитокинов на поверхности В-лимфоцитов и в дальнейшем проникать в клетки. Это взаимодействие повышает уровни экспрессии ряда цитокинов в клетках-мишенях (IL-6 и IL-10) и запускает МАР-киназный каскад с активацией фактора NFkB, который обеспечивает поли- и олигоклональную экспансию В-клеток (Li et al., 2005; Vendrame et al., 2014). Во-вторых, Tat-белок способен опосредованно влиять на клетки через их микроокружение: при выходе в кровь он связывается с эндотелиальными клетками или интернализуется ими, инициируя экспрессию поверхностных молекул адгезии на эндотелии (VCAM, ICAM и E-селектина). Это активирует миграцию B-лимфоцитов в лимфоузлы (Chirivi et al., 1999). В заключение, Tat-белок в интерфазном ядре способствует пространственному сближению локусов генов C-MYC и IGH, что увеличивает риск транслокации между ними (Germini et al., 2017). Данная транслокация t(8;14)(q24;q32) характерна для лимфомы Беркитта. Некоторые данные указывают на способность Tat-белка вызывать гиперэкспрессию генов антиапоптотических белков, например Bcl-2, в моноцитарных, макрофагальных и некоторых Т-клеточных культурах T, однако это свойство Tat никогда не ассоциировалось с В-клеточным лимфомагенезом. Наши предварительные данные позволяют предложить гипотезу о роли Тat-белка при гиперэкспрессии антиапоптотических белков в В-клетках. Очевидно, что это может влиять на клональную селекцию В-лимфоцитов, проходящую в герминальных центрах фолликулов лимфоузлов. В этом случае Tat-белок может обеспечивать дополнительную неспецифическую защиту от апоптоза в В-клетках, однако непосредственные сигнальные нарушения в этом процессе еще не выявлены. Таким образом, целью данного проекта является проверка гипотезы о Тat-индуцированном приобретении антиапоптотического фенотипа В-клетками. Предложенные эксперименты включают исследование воздействия Tat-белка на уровень и динамику процесса апоптоза в перевиваемой В-лимфобластной культуре и B-клетках здоровых доноров ex vivo. Будут определены сигнальные каскады, задействованные в регуляции апоптоза, и гены, ответственные за изменение программы клеточной гибели в В-клетках. Полученные данные помогут прояснить механизмы В-клеточного лимфомагенеза у ВИЧ-инфицированных пациентов и разработать стратегии предотвращения и терапии данных опухолей. Основной экспериментальной моделью в данном проекте являются клетки культуры RPMI8866 (Sigma), трансдуцированные лентивирусом для стабильной экспрессии Tat-EGFP (клеточные линии получены в НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского, МГУ). Уровень экспрессии Tat-белка, слитого с EGFP (Tat-EGFP), на клетку будет оцениваться по интенсивности флуоресценции EGFP. Сравнение культур с экспрессией Tat-EGFP и одиночного EGFP позволит приписать наблюдаемые эффекты Tat-белку, а сравнение культур с экспрессией Tat-EGFP и TatC22-EGFP (Tat-мутант с подавленной трансактивацией) позволит отделить эффекты Tat, связанные с транскрипцией, от прочих эффектов. Уровни экспрессии про- и антиапоптотических генов будет также измерена в В-лимфоцитах здоровых доноров, инкубированных с рекомбинантным Tat-белком. Исследование роли Tat-белка в индукции апоптоза будет проводиться современным методом проточной цитофлуориметрии (FACS), особенную значимость представляют оригинальные протоколы мультипараметрической оценки процесса апоптоза, разработанные в нашей лаборатории и позволяющие наблюдать кинетику данного процесса в популяции клеток. Это позволит выделить клетки на ранней, средней и поздней стадии апоптоза, и количественно оценить динамику и обратимость данного процесса (Vorobjev, Barteneva, 2015, 2016). Уровни экспрессии мРНК генов сигнальных каскадов, участвующих в запуске апоптоза, будут исследованы методом ПЦР в реальном времени и подтверждены на белковом уровне вестерн блотом и иммунофлуоресцентной микроскопией.

Upon introduction of highly efficient antiretroviral agents in HAART regimens B-cell lymphomas emerged as a serious by-product and one of the major causes of death among HIV-infected patients (Bibas & Antinori 2009; Han et al. 2016). The most prominent HIV-associated lymphomas include Burkitt’s lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and other aggressive non-Hodgkin lymphomas (Gopal et al., 2013). Interestingly, they are of B-cell origin, although B-cells are not directly infected by HIV. Thus, malignization mechanisms of HIV-associated B-cell lymphomas are still poorly understood, which makes the proposed study relevant. The putative HIV-related oncogenesis driver is a small (14 kDa) HIV-produced transcription activator protein Tat (trans-activator of transcription). Tat protein triggers the viral genes' transcription (Van Lint et al., 2013) and modulates various intracellular processes by direct interactions with nuclear components (Romani et al., 2010). Tat protein can leave infected cells and is detected at significant rates in blood plasma of HIV-infected patients (Westendorp et al., 1995) even undergoing anti-retroviral therapy (Mediouni et al., 2012). Tat protein released by infected cells can enter uninfected cells including B-lymphocytes (reviewed in Musinova et al., 2016). As a result, the HIV patients' B-cells are Tat-positive albeit HIV-negative ((Frankel & Pabo, 1988); reviewed in: (Musinova et al., 2016)). This may trigger B-cell lymphomagenesis as demonstrated on transgenic mice (Kundu et al., 1999). The mechanisms of HIV-related B-lymphomagenesis encompasses several factors. First, Tat protein leaves infected cells and enters bloodflow, binds non-specifically to chemokine receptors on B-lymphocyte surface and penetrates the cell. This interaction induces enhanced cytokine expression in target cells (e.g., IL-6 and IL-10) and activates МАР-kinase signaling cascade and downstream NFkB, that results in polyclonal and oligoclonal B-cell expansion (Li et al., 2005; Vendrame et al., 2014). Second, Tat protein may promote supporting microenvironment: upon blood release it binds endothelial cells or is internalized by them thus inducing adhesion molecule expression (VCAM, ICAM and E-selectin). This activates tumor B-cell migration to lymph nodes (Chirivi et al., 1999). Finally, Tat protein can promote spatial alignment of C-MYC and IGH genes in interphase nuclei, which raises the risk of loci translocation (Germini et al., 2017). Such translocation t(8;14)(q24;q32) is characteristic of Burkitt’s lymphoma. Some data indicate that Tat induces overexpression of anti-apoptotic proteins, particularly Bcl-2, in monocyte, macrophage and some T-cell lineage cultures, however this quality of Tat has never before been directly associated with B-cell lymphomagenesis. Our preliminary data allows to suggest a hypothesis of Тat-induced anti-apoptotic protein overexpression in B-cells. Apparently, this can affect B-cell clonal selection that proceeds in lymph node follicular germinal centers. Here Tat may provide additional non-specific apoptosis protection for B-cells, however the putative mechanisms of such signaling dysregulation still need to be elucidated. The aim of the current project is thus to test the hypothesis of Тat-induced anti-apoptotic phenotype acquisition by B-cells. The proposed experimental design includes the investigation of Tat protein impact on the rate and dynamics of apoptosis execution in В-lymphoblastoid cell cultures and normal human B-cells ex vivo. The signaling pathway(s) involved in apoptotic regulation and the genes responsible for apoptotic program alterations will be defined. The data obtained will help clarify the mechanisms of B-cell lymphomagenesis in HIV-infected patients and develop strategies of both tumor treatment and prevention. The basic experimental model for the proposed project are cultured lymphoblasts RPMI8866 (Sigma) lentivirally transduced for stable Tat-EGFP fused protein expression (cell lines were obtained in A.N. Belozersky Institute). The expression levels of Tat protein fused with EGFP (Tat-EGFP) will be assessed by EGFP fluorescence intensity. Tat-EGFP versus EGFP comparison will allow to attribute the observed effects to Tat protein, Tat-EGFP versus TatC22-EGFP (Tat mutant with suppressed transactivation) will help to separate the transcription-related effects of Tat from other possible effects. Pro- and anti-apoptotic gene expression will be additionally assessed in healthy donor B-cells isolated from peripheral blood and incubated with recombinant Tat protein. To study the possible role of Tat in apoptosis induction, the present-day method of flow cytometry (FACS) will be employed, particularly the original approaches of multiparameter apoptosis characterization that allows to dissect the kinetics of the process in the population. This allows to define cells at early, middle and late apoptosis stages, and quantitatively assess the reversibility of programmed cell death (Vorobjev, Barteneva, 2015, 2016). Gene expression levels and the roles of specific signaling cascades in apoptosis will be analyzed predominantly by real-time qPCR with data verification at protein level by Western blot and immunofluorescence microscopy.

1. Оценка воздействия Tat-белка на кинетику апоптоза в клетках перевиваемой культуры RPMI8866.
 На первом этапе проекта предполагается описать уровень спонтанного апоптоза и его развернутую кинетику в клетках RPMI8866, стабильно экспрессирующих Tat-белок. Полученные результаты предполагается сравнить сравнить с кинетикой апоптоза в клетках с нефункциональным Tat-белком (TatC22) и контрольных культурах (EGFP и без конструктов). В качестве маркеров апоптоза предполагается использовать: флуоресцентно меченый аннексин V (маркер выхода фосфатидилсерина в наружный слой плазматической мембраны), TMRE (потенциал-зависимый флуоресцентный краситель митохондрий), флуоресцентные сенсоры на активные каспазы 3 и 7 и Sytox blue (индикатор пермеабиализации клеточных мембран). Морфологические изменения, характерные для апоптоза (сжатие клеток – Apoptotic volume decrease) также будут визуализированы с помощью проточной цитофлуориметрии. В дальнейшем, для исследования кинетики индуцированного апоптоза предполагается использовать Fas лиганд (CD95L). В качестве менее специфиченых воздействий предполагается использовать микротрубочковые яды (таксол, винорельбин), которые являются компонентами многих противоопухолевых терапевтических схем. Мультипараметрическое описание клеточной гибели в Tat-экспрессирующих клетках RPMI8866 ранее не проводилось. 2. Выявление про- и антиапоптических генов, экспрессия которых изменяется под действием Tat-белка. На втором этапе проекта будет проведен анализ уровней экспрессии про- и антиапоптических генов в лимфоцитах, стабильно экспрессирующих Tat-белок. Отбор генов будет проведен на основе биоинформатического анализа данных по секвенированию транскриптомов (mRNA-seq). Результаты секвенирования для использованных культур предоставлены Егором Васецким (Институт Густава Русси, Франция), биоинформатический анализ будет проведен в ходе выполнения проекта. Результаты mRNA-seq будут подтверждены методом ПЦР в реальном времени с использованием оптимальной комбинации референтных генов для нормальных и опухолевых В-клеток, как описано нами ранее (Potashnikova et al., 2015). Профили экспрессии генов на уровне мРНК для наиболее важных генов будут подтверждены профилями экспрессии на уровне белка с помощью метода вестерн-блота. Сравнение уровней экспрессии про- и антиапоптических генов будет проводиться между культурами, стабильно экспрессирующими Tat-белок, с нефункциональным Tat-белком (TatC22) и контрольными культурами лимбобластов (EGFP и без конструктов). Предварительные данные были получены для некоторых сигнальных молекул, связанных с В-клеточным рецептором (Syk, Lyn, SHP-1, CD79a, CD79b) для В-клеточных лимфом и нормальных В-лимфоцитов (Gladkikh, Potashnikova et al., 2017). 3. Клетки RPMI8866 со стабильной экспрессией Tat будут подвергнуты развернутому иммунофенотипированию активационных маркеров, что позволит подтвердить гипотезу о роли Tat-белка в изменении профиля экспрессии сигнальных молекул на клетках. Данное исследование важно для развития стратегии предотвращения лимфом у ВИЧ-инфицированных пациентов и для поиска молекулярных мишеней в персонализированной терапии лимфом. Так, при невозможности прямого подавления Tat-белка, компоненты активируемого им сигнального каскада, экспрессируемые антиапоптотические белки и иммунофенотипические маркеры опухоли могут оказаться ценными терапевтическими мишенями.

Руководитель проекта на протяжении 8 лет занимается мультипараметрическим иммунофенотипированием лимфопролиферативных заболеваний и изучением сигнальных каскадов, регулирующих программу активации и защиты от апоптоза в В-клеточных лимфомах. В опубликованных работах используются методы проточной цитофлуориметрии и сортировки клеток (FACS), световой микроскопии, ПЦР в реальном времени и т.д. В ходе ранее проведенных работ были получены следующие результаты, которые будут востребованы в ходе проведения заявленного проекта: 1. В процессе изучения уровней экспрессии генов различных сигнальных молекул в клетках В-зрелоклеточных лимфом был идентифицирован набор наиболее стабильно экспрессируемых референтных генов в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани (Potashnikova et al., 2015) для нормализации данных ПЦР в реальном времени. Использование этих референтных генов позволяет точнее анализировать экспрессию генов в В-лимфоцитах или клетках В-зрелоклеточных лимфом, по сравнению с другими методами нормализации данных. 2. В результате исследования уровней экспрессии генов сигнальных молекул в опухолевых и здоровых лимфоцитах были получены данные по экспрессии как эффекторных генов сигнальных белков (Gladkikh et al., 2010; Gladkikh et al., 2011) так и генов тирозинкиназ сигнального каскада от В-клеточного рецептора (Barteneva et al., 2013; Potashnikova et al., 2012; Gladkikh, Potashnikova et al., 2017). Было показано, что конститутивная активация сигнального каскада от В-клеточного рецептора вносит основной вклад в устойчивость к апоптозу опухолевых зрелых В-лимфоцитов (Gladkikh, Potashnikova et al., 2017). Отработанные методики будут использоваться при изучении влияния Tat-белка на В-лимфоциты в рамках заявленного проекта.

Результаты первого этапа будут включать: 1. Описание клеточных моделей со стабильной экспрессией Tat-белка, с нефункциональным Tat-белком и контрольных клеточных линий. 2. Описание динамики спонтанных апоптотических процессов в перечисленных клеточных линиях. 3. Описание динамики индуцированных апоптотических процессов в перечисленных клеточных линиях. Результаты второго этапа будут включать: 1. Анализ данных РНК-секвенирования для клеточных линий лимфобластоидных клеток с постоянной экспрессией Tat-белка. 2. Подтверждение изменения уровня экспрессии наиболее значимых генов апоптотических путей методом ПЦР в реальном времени с нормализацией по трем референтным генам. 3. Подтверждение изменения профиля экспрессии ключевых генов на уровне белка методом вестерн-блота. 4. Сравнение полученных данных для культур, стабильно экспрессирующих Tat-белок, с нефункциональным Tat-белком (TatC22) и контрольных культур. 5. Анализ уровня экспрессии выбранных про- и антиапоптотических генов в В-лимфоцитах здоровых доноров, инкубировавшихся в присутствии рекомбинантного Tat-белка. В-лимфоциты будут выделяться из периферических мононуклеаров крови здоровых доноров методом многоцветной сортировки. Результаты третьего этапа будут включать: 1. Описание изменений поверхностного иммунофенотипа (уровней экспрессии маркеров В-клеточной активации, рецепторов цитокинов) лимфобластоидных клеточных линий, экспрессирующих / не экспрессирующих Tat-белок, методом многоцветной проточной цитофлуориметрии. 2. Описание изменений поверхностного иммунофенотипа (уровней экспрессии маркеров В-клеточной активации, рецепторов цитокинов) В-лимфоцитов здоровых доноров при/в отсутствие инкубации с Tat-белком методом многоцветной проточной цитофлуориметрии. 3. Описание влияния Tat-белка на экспрессию основных генов-участников сигнального каскада от В-клеточного рецептора (CD79a, CD79b, Syk, Lyn, SHP-1,), а также участников каскадов от рецепторов цитокинов (Jak, Stat).