Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеванийНИР

Complexation of new benzoazacrown-ethers of Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+ and Bi3+ cations and synthesis of radiopharmaceutical on their base with octreotide for theranostics of oncological diseases

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июля 2018 г.-30 июня 2019 г. Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеваний
Результаты этапа: Был выбран и отработан наиболее эффективный метод получения азакраун-соединений, основанный на макроциклизации между сложными диэфирами и аминами с последующим восстановлением амидных групп, т.к. дает значительно большие выходы. Был разработан метод введения карбоксильных групп в структуру полученных бензоазакраун-соединений. Мы оптимизировали двухстадийный метод, в котором алкилирование азакраун-соединений 4 и 5 проводилось этиловым или трет-бутиловым эфиром соответствующей кислоты в присутствии карбоната калия в качестве основания. Затем сложноэфирные группы гидролизовали. В отличие от известных литературных методик для гидролиза трет-бутильных групп не применялся кислотный катализ, что позволило упростить выделение и очистку хелатных производных 13 и 14. Также нами был предложен оригинальный подход к синтезу комплексонов такого типа, в котором проводилось последовательное введение сначала одной пиридильной группы, затем двух карбоксильных. Для этого бензоазакраун-соединение 7 алкилировали хлорметилпиридином в ацетонитриле и восстанавливали бораном. Дальнейшее алкилирование соединения 16 трет-бутиловым эфиром бромуксусной кислоты и гидролиз производного 17 позволили получить целевой лиганд 18. Все полученные соединения были охарактеризованы различными физико-химическими методами (ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия, элементный анализ, ИК-спектроскопия) для подтверждения их структуры и чистоты. Были определены константы протонирования 3 синтезированных лигандов. Показано, что по мере увеличения донорных атомов константы протонирования закономерно увеличиваются. Все ступенчатые константы протонирования соответствуют диапазону значений характерных для полиаминов и полиаминополикарбоксилатов. Во всех случаях наблюдалось образование комплексов состава M:L=1:1. Среди рассматриваемых лигандов L4, у которого отсутствуют карбоксильные группы, не образовывал комплексов при потенциометрическом титровании с катионами Y3+, Sc3+ и Bi3+. C ростом константы протонирования увеличиваются и константы комплексообразования для всех рассматриваемых катионов. Рассчитанные значения lgK комплексов Cu2+ и Bi3+ с L14 и L13 сравнимы или даже превышают аналогичные значения для комплексов с DOTA – лигандом, наиболее широко используемым в радиофармпрепаратах (lgK(Cu-DOTA)=22,2 7, lgK(Bi-DOTA)=30,3 8). Необходимо дальнейшее тестирование комплексов-лидеров из рассмотренных Cu-L13, Cu-L14, Bi-L13 и Bi-L14 на устойчивость in vitro и in vivo. В случае Bi3+ константы комплексообразования с лигандами L13 и L14 были рассчитаны также методом конкурентного взаимодействия с использованием жидкостной экстракции. Стехиометрическое соотношение M:L=1:1, определённое методом экстракции, подтверждает стехиометрию, определённую методом потенциометрического титрования. Однако рассчитанные значения констант комплексообразования lgK(Bi-L13)=25,5±0,4 и lgK(Bi-L14)=33,7±0,4 (при рН3), lgK(Bi-L14)=31,2±0,5 (при рН4), lgK(Bi-L14)=29,7±0,6 (при рН5) отличаются на 2-3 порядка от полученных методом потенциометрического титрования. Установлено, что при связывании катионов Pb2+ и Bi3+ L13 формируются комплексы, обладающие жесткой структурой, которые характеризуются С2-симметрией. 2 противоположно расположенные карбоксильные группы фиксированы, а третья (центральная) карбоксильная группа вращается, поскольку для нее не наблюдается расщепление сигналов протонов СН2-группы. При этом все гетероатомы лиганда участвуют в координации катиона металла, однако в случае комплекса Pb-L13 взаимодействие фенильных атомов кислородов слабое или отсутствует. Анализ комплекса Y-L13 с помощью ЯМР показал, что при комплексообразовании макроцикл принимает жесткую конформацию, аналогично Pb-L13 и Bi-L13, при этом карбоксильные группы остаются подвижны и вращаются. Изучение комплексов L13 с использованием ИК-спектроскопии показало, что при связывании катиона лиганд переходит в карбоксилатную форму, при этом с разными катионами металлов имеет место различная степень ионного взаимодействия. Для подтверждения состава комплексов полученных лигандов с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ проведен анализ водных растворов лигандов в присутствии солей соответствующих металлов методом масс-спектрометрии (ионизация – электроспрей). Во всех случаях наблюдались сигналы, соответствующие комплексам состава 1:1. С помощью рентгеноструктурного анализа монокристалла комплекса краун-соединения L13 с катионом Bi3+ были определены особенности его строения. Установлено, что в координации катиона участвуют все гетероатомы макроцикла, а также три карбоксильные группы, стабилизируя катион за счет ионного взаимодействия. Размер Bi3+ превышает размер макроциклической полости, поэтому катион располагается над ней, приводя к ее искажению, при этом карбоксилы находятся с одной стороны от плоскости макроцикла для более эффективной координации металла.
2 1 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеваний
Результаты этапа: 1) Подобраны условия проведения анализа меченных лигандов методами ТСХ и/или ВЭЖХ: подвижная фаза (элюент), неподвижная фаза (пластина, колонка), режим элюирования; 2) Меченные комплексы с наиболее высокими значениями констант устойчивости среди исследованных в данном проекте исследованы на сохранение диссоциативной стабильности в средах биологического значения: буферах, физиологическом растворе, в присутствии биогенных катионов Zn2+, Mg2+, Ca2+, Cu2+ и Fe3+ и сывороточных белков; 3) Определены условия получения наиболее перспективных меченных соединений: pH, температура, концентрационный диапазон, продолжительность синтеза; 4) Исследовано биораспределение наиболее перспективных комплексов in vivo в организме лабораторных мышей, при необходимости будут проведены эксперименты с референсными лигандами; 5) Получены бензокраунэфиры с пропионатными карбоксильными группами; 6) Синтезированы реагенты для получения бифункционального хелатора.
3 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеваний
Результаты этапа: 1) формы с двумя и тремя пропионатными и бутиратными группами; Введение пропионатных и бутиратных групп в структуру макроцикла 1 проводилось путем алкилирования этил 3-бромпропионатом и этил 4-бромбутиратом соответственно. Реакция проводилась в различных условиях: варьировался растворитель (ацетонитрил, ДМФА), температура (80°C, 100°С), основание (карбонат калия, гидроксид калия), использовались добавки йодида калия (Схема 1). В результате удалось получить целевой продукт в смеси с продуктом неполного алкилирования, содержащего две хелатирующие группы вместо трех, несмотря на использование избытка алкилирующего агента (выход установлен по ЯМР). Это может быть связано с пониженной электрофильностью алкилирующего агента, а также с образованием водородной связи между свободной вторичной аминогруппой и карбонильным кислородом карбоксигруппы, которая препятствует дальнейшему взаимодействию по третьей аминогруппе макроцикла. 2) бифункциональные производные бензоазакраун-эфиров и получены для конъгирования с октреотидом и другими биомолекулами; Для конъюгации хелатора с биомолекулами нами было предложено ввести дополнительную реакционноспособную группу в бензольное кольцо. Такое расположение удобно, поскольку не затрагивает хелатирующие группы макроцикла, тем самым не влияя на прочность и геометрию образуемого комплекса, а также минимизирует стерические препятствия для взаимодействия катиона с координирующими центрами лиганда. В качестве функциональной группы была выбрана сложноэфирная в связи с тем, что она может быть относительно легко переведена в карбоновую кислоту, амид, спирт или другие соединения с хорошими выходами в мягких условиях. Кроме того, метиловый эфир может быть селективно гидролизован в присутствии трет-бутильных эфирных групп с использованием щелочных условий гидролиза. Практический интерес также представляет гидроксильная группа, поскольку ее можно легко модифицировать, заместив на галогенид и азид, с помощью которых макроцикл можно ковалентно связывать с различными Полученное бифункциональное производное, содержащее азидную группу, в дальнейшем можно использовать для получения конъюгатов с различными молекулами по клик-реакции азид-алкинового циклоприсоединения. 3) конъюгат бензоазакраун-эфира с октреотидоми и очищен до необходимой для дальнейшего исследования степени; Для подбора методик и оптимизации условий синтеза конъюгатов с октреотидом в качестве модельного соединения был использован полученный нами ранее бензоазакраун-эфир с четырьмя карбоксильными группами 19. В результате анализа литературных методик получения конъюгатов с биомолекулами нами был выбран следующий подход. На первой стадии при взаимодействии хелатора 19 с N-гидроксисукцинимидом (NHS) в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) в воде образовывался активированный эфир 20. Далее при взаимодействии с октреотидом в присутствии в качестве основания диизопропилэтиламина (DIPEA) образовывался целевой конъюгат 19-октреотид (далее BATA-октреотид, benzoazacrown tetraacetate-octreotide). Полученный продукт был очищен с помощью картриджа Sep-pak 4) Будут отработаны условия анализа меченного нового конъюгата,; ВЭЖХ анализ проводили в следующем режиме: А - 0,1% ТФК в H2O, Б - 0,1% ТФК в CH3CN. Градиент элюирования -линейный: 0-20 мин 95-40% А, 20-25 мин 40% А, 25-30 мин 40-10% А, 30-35 мин 10-95% А. Свободный висмут выходил в мертвом объёме колонки в течение первых 4 минут, меченный конъюгат при 10 минутах. 5) Будут оптимизированы условия получения меченного конъюгата, по крайней мере, с катионом радионуклида висмута; Мечение проводили как в буфере с NH4OAc (не использовался NaOAc во избежание примесей металла) с итоговой концентрацией 0,2 M, так и в буфере MES с итоговой концентрацией 0,01 M, pH5, 6, 7. pH растворов устанавливали аммиаком или HCl (HPLC grade) для снижения металлических примесей. Посуда из полипропилена была предварительно очищена от примесей металлов. На РХЧ получаемого меченного конъюгата варьирование рН5-7 не оказывало влияния, однако включения >90% радионуклида в меченный конъюгат уалось достигнуть только при концентрации конъюгата BATA-октреотид 1 мМ. 6) Меченный конъюгат будет исследован на предмет устойчивости в средах биологического назначения, в присутствии катионов микроэлементов, в сравнении с проведёнными на 2 этапе результатами для хелатора без пептида; На данном этапе нами был протестирован полученный меченный 207Bi конъюгат ВАТА-октреотид в среде сывороточных белков при разбавлении сывороткой в 2 и 10 раз. Связывание конъюгатом радионуклида висмута происходит аналогично лиганду до конъюгирования, и образуемый комплекс сохраняет высокую стабильность несмотря на дезактивацию одной из хелатирующих групп. Важно отметить, что аналогичный меченный 44Sc конъюгат нестабилен in vitro. Возможно, что для небольшого жёсткого катиона Sc3+ наличие всех 4 координирующих групп более критично для сохранения целостности комплекса. Для оценки устойчивости меченного конъюгата в среде живого организма было проведено исследование in vivo в нормальных лабораторных мышах. Для инъекции использовали конъюгат, меченный 207Bi (3 кБк) c РХЧ 90%. В целом, профиль биораспределения сохраняется, клиренс осуществляется посредством почек, но выведение уже медленнее, чем в случае исходного лиганда, и быстрее, чем в случае EDTA: % введенной дозы, оставшийся в организме через 1 час после инъекции составляет 95±8%, 70±10% и 20±10% для комплексов [207Bi]BiEDTA, [207Bi]BiBATA-октреотид и [207Bi]BiBATA, соответственно. На данном временном интервале важно отметить на порядок бόльшее накопление в мозге по сравнению с обоими комплексами с ВАТА и ЕDTA, что может быть обусловлено именно экспрессией рецепторов соматостатина клетками гипофиза. 7) будут исследованы кинетические особенности получения комплексов с лигандами, а также их диссоциации в экстремальной среде, например, в сильнокислой среде; В случае хелатирующего агента DOTA, механизм диссоциации комплекса основан на протонировании атомов азота циклического фрагмента. Можно предположить, что для циклических фрагментов большего размера как у L13 и L14 протонирование гетероатомов происходит быстрее и легче, чем для циклических фрагментов меньшего размера, как у лиганда DOTA. В итоге образуемый комплекс менее кинетически устойчив к диссоциации в избытке протонов: τ1/2=26 мин в 0,1 М HCl для Bi-L14 vs 23 мин в 1 М HCl для Bi-DOTA. Однако, с практической точки зрения не предполагается, что данный комплекс может оказаться в среде организма при рН1 и ниже, где высвобождение радионуклида может происходить по данному пути. Вследствие быстрой скорости образования, получение комплексов может быть зафиксировано только при низком значении рН. Поэтому образование комплексов также оценивали при рН1 по аналогичному изменению спектра поглощения по пикам комплекса с L13, L14 и хлоридному. Однако в данном случае использовали условия реакции второго порядка. Полученные зависимости показали более медленное образование для комплекса с L14. 8) Будут исследованы комплексообразующие свойства пиридин-содержащего бензоазакраун-эфира Был исследован лиганд с пиридиновой группой L13py. Согласно потенциометрическому титрованию lgK1H=9,0±0,1; lgK2H=8,1±0,1; lgK3H=3,7±0,1; lgK4H=2,9±0,1. Замещение одной из ацетатных групп в L13 на пиридиновую в L13py приводит к снижению комплексообразующей способности. Константа с Y3+ ниже, а с катионами Sc3+ и Bi3+ определить значение не удалось, ввиду образования нерастворимых гидролизных форм катионов. При этом комплексы с Pb2+ и Cu2+ образуются с значениями lgK близкими значениям с L13. В случае более мягкого и меньшего по радиусу Сu2+ константа с пиридиновым производным выше на 1 порядок, а для Pb2+ ниже. Для характеризации меченных соединений с пиридиновым лигандом использовали радионуклид 210Pb. Для сравнения параллельно проводили эксперимент с L13. Согласно полученным результатам, в течение суток при инкубировании в среде сывороточных белков диссоциации не наблюдается, затем через сутки в случае L13py высвобождается более 30%, в то время как комплекс с ацетатным L13 начинает диссоциировать только на вторые сутки. Отсутствие эффективного связывания катиона Bi3+ было подтверждено при эксперименте получения меченного соединения: даже при концентрации лиганда 2-5 мМ связать катион на более чем 40-50% не удалось. 9) Комплексы Sc3+, Y3+ и Bi3+ будут доисследованы in vitro и in vivo. Проверяли влияние сывороточных белков на перехелатирование катионов из комплексных соединений. в 10- или 100-кратном избытке сыворотки при 37ºС в течение некоторого времени. Согласно полученным результатам PbL13 и ScL14, а также исследованный in vitro на прошлом этапе BiL13, представляются перспективными для исследования в условиях in vivo. Комплексы Sc3+ и Y3+ с L13 оказались неустойчивыми к диссоциации в присутствии 2- и 10-кратного избытка сывороточных белков. При этом в присутствии катионов диссоциации не наблюдается. Исследовали биораспределение комплексов в организме здоровых мышей. Профиль биораспределения [207Bi]BiL13 схож с распределением комплексов [207Bi]BiL14 и [207Bi]BiDOTA, изученными ранее. Однако, биораспределение [207Bi]BiL13 имеет сходство и с распределением in vivo комплекса [207Bi]BiEDTA, который известен неустойчивостью в биологических средах. Медленное выведение комплекса с L13 проявляется в высоком содержании радиоактивности в органах даже через 6 часов. Аналогично висмутовым комплексам было проведено исследование in vivo комплекса [44Sc]Sc-L14 также в сравнении с несвязанным в комплекс [44Sc]Sc3+. В данном случае, значительного различия в накоплении по органам не наблюдается, однако можно отметить, что через 1 час после введения суммарно в организме остаётся 27±10% в.д. в то время как в случае свободного катиона остается 80±15% в.д., что однозначно свидетельствует о быстром клиренсе из организма при введении в виде комплекса с L14.
4 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеваний
Результаты этапа:
5 1 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. Комплексообразование новых бензоазакраун-эфиров с катионами Sc3+, Cu2+, Y3+, Pb2+, Bi3+ и получение радиофармпрепарата на их основе с октреотидом для тераностики онкологических заболеваний
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".