«Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектов»НИР

The development of DNA-aptamer-based optical sensors for the detection of biological objects

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 30 июня 2018 г.-30 июня 2019 г. «Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектов»
Результаты этапа: В качестве узнающих элементов аптасенсоров выбраны аптамеры к гемагглютинину вируса гриппа, который является поверхностным белком, отвечающим за узнавание клетки-хозяина. Специфичность 10 ДНК-аптамеров к была оценена на нескольких подтипах вируса гриппа. В качестве лидеров выбраны аптамеры с широкой специфичностью и наибольшей интенсивностью сигнала. Интерферометрическим методом и аптаферментным анализом были определены константы взаимодействия вирусов разных подтипов с аптамерами BV42 и RHA0385. Сравнение аптамера RHA0385 и его производных, G7-1, G7-2 и G7-3, показывает, что все они обладают высокой аффинностью к вирусным частицам (кКд ниже 20 нМ). Однако, в случае G7-3 аффинность к вирусу H3N2 понижена в 10 раз; следовательно изменение последовательности нуклеотидов большой петли влияет на селективность аптамеров. Наименьшая амплитуда изменения селективности была у аптамера G7-1 (в 1,2-1,7 раза). Кроме того, методы ЯМР и ВЭЖХ гель-фильтрации показали, что G7-1 содержит наименьшее число олигомеров, а его мономерная фракция представляет собой индивидуальный конформер. Были изучены разные модификации аптамера RHA0385. Производные были изучены методами спектроскопии кругового дихроизма и ВЭЖХ гель-фильтрации. Тиоловая модификация по 5’- или 3’-концам незначительно влияет на термодинамические параметры G-квадруплекса. Модификации флуоресцентным красителем могут оказывать более выраженное влияние. Так, введение Cy5 привело к снижению абсолютных значений энтальпии и энтропии. Аптасенсор с производным Cy5 был единственным, не давшим рамановского спектра красителя. Производное RHA0385-3’-Cy3 обладало наибольшими абсолютными значениями термодинамических параметров; данный аптамер был успешно использован для детекции вируса гриппа. Наиболее близкие к исходному аптамеру термодинамические параметры были у производного с красителем BDP FL, который также успешно использован для детекции вируса гриппа. В качестве SERS-сенсоров были испытаны несколько вариантов: А) Коллоидные металлические наночастицы различных форм и размеров Б) многослойные металл-диэлектрические структуры с различными комбинациями металлов (Ag, Au, Al) и диэлектриков (SiO, SiO2, Al2O3, TiO2) В) островковые металлические слои на поверхности диэлектриков Г) периодические диэлектрические структуры с толстым металлическим слоем, в которых реализуется гигантское усиление сигналов рамановского рассеяния света и люминесценции за счет комбинации диэлектрического и плазмонного резонанса. Предварительные испытания разных типов SERS-сенсоров выявили подложки типа В и Г как дающие наибольшую интенсивность сигнала. Отжиг подложек типа В и этап напыления хрома на подложки типа Г улучшают адгезивные свойства поверхностей подложек соответствующего типа, что препятствует их повреждению в процессе выполнения эксперимента по высокочувствительному выявлению вируса гриппа. Подложки типа Г изготавливаются с помощью методов электронной литографии и плазмохимического травления, в связи с чем они являются дорогостоящими и их массовое производство для создания методики по экспресс-определению вируса гриппа в низких концентрациях затруднено. В дальнейшем в рамках данного проекта планируется при производстве подложек данного типа переход на фотолитографию, что позволит масштабировать их выпуск. Подложки типа В достаточно просты в изготовлении, обладают высоким коэффициентом усиления оптического отклика от исследуемых молекул и являются экономически обоснованными при производстве. Именно на этих подложках была разработан прототип SERS-сенсора для высокочувствительного выявления вируса гриппа. В процессе выполнения проекта был произведен сравнительный анализ различных SERS-репортеров с целью оптимизации по чувствительности полного «сэндвич»-метода. При возбуждении лазерным светом с длиной волны 532 нм были проверены различные резонансные (Су3, TAMRA, BDP R6G) и нерезонансные (Cy5, Cy5.5, Cy7, FAM, BDPFL, MG) для такого излучения красители. В эксперименте по детектированию вируса гриппа были использованы вторичные аптамеры, меченные коммерчески доступными активированными эфирами Cy3 и BDPFL, обладающими хорошим рамановским откликом при относительно низкой фотолюминесценции. Используя SERS-подложки типа В и производные аптамера RHA0385, был создан и протестирован прототип аптасенсора для определения вируса гриппа. Аптасенсор представляет собой сэндвич из первичного аптамера (тиол-модифицированный аптамер, иммобилизованный на SERS-подложке с наноструктурированном серебром), вируса гриппа и вторичного аптамера (аптамер, модифицированный SERS-активным соединением). Детектируемый сигнал – интенсивность одной из линий рамановского спектра SERS-активного соединения. Интенсивность сигнала коррелирует с количеством вируса, сорбированного на сенсоре. Выбор сэндвич-методики основан на том, что такие методики обладают большей чувствительностью за счет снижения уровня фонового сигнала. Предложенная методика подробно описана в разделе о фактическом выполнении плана работ. Для комбинации производных аптамера RHA0385, (SH-(CH2)6)- 5’-RHA0385 и Cy3-5’-RHA0385, был определен предел обнаружения вируса гриппа. Для штамма H3N2, A/England/42/1972 предел обнаружения составил 5∙10^4 вирусных частиц в мл. Аналогичное значение предела обнаружения штамма H3N2, A/England/42/1972 было определено для комбинации производных аптамера RHA0385, (SH-(CH2)6)- 5’-RHA0385 и BDP FL-5’-RHA0385. Предложенный прототип аптасенсора (с Cy3 меткой вторичного аптамера) был опробован на нескольких штаммах вирусов, включая подтипы Н1, Н3, Н4, Н5, Н9, Н12. Все перечисленные подтипы вируса гриппа А были успешно детектированы. Кроме того, были опробованы комбинации разных аптамеров, например, SH-5’-RHA0385 и BV42-Cy3, SH-5’-RHA0385 и RHA0006-Cy3, SH-5’-RHA0385 и A22-Cy3. Все комбинации успешно детектировали вирус гриппа подтипа H3N2. Однако, наибольший сигнал был достигнут в исходной комбинации модифицированных аптамеров RHA0385. Дальнейшая работа будет направлена на снижение фонового сигнала аптасенсора, что может повысить предел обнаружения вируса гриппа.
2 1 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. «Создание оптических сенсоров на основе ДНК-аптамеров для детектирования биологических объектов»
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".