Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiaeНИР

Molecular mechanisms and the physiological role of non-vesicular transport of sterols between the plasma membrane and intracellular compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 20 апреля 2018 г.-31 декабря 2018 г. Молекулярные механизмы и физиологическая роль невезикулярного транспорта стеринов между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Результаты этапа: 1. В ходе выполнения проекта были сконструированы более 40 штаммов. Все штаммы были получены путем трансформации родительского штамма кассетой генов, содержащей модифицированную последовательность дрожжевого генома и последовательность маркерного гена. Правильность интеграций подтверждена ПЦР с проверочными праймерами. 2. Было показано, что lam мутанты, включая одиночный мутант lam2, более чувствительны к серии из чередований замораживаний-оттаиваний и тепловому стрессу 45С, чем дикий тип, причем степень чувствительность возрастала по мере увеличения числа делеций lam генов. 3. Было показано, что штаммы lam2lam4 и lam1lam2lam3lam4 в отличее от дикого типа и lam1l1m3 оказались неспособны расти в богатой среде (YPD), в которую был добавлен этанол (конечная концентрация 8 объемных %). С другой стороны — для роста в присутствие 5% пропанола было достаточно присутствия любой из двух пар паралогичных генов. Это говорит о частичной функциональной заменяемости генов не только внутри пар, но и между пар LAM2/LAM4 и LAM1/LAM3 4. Мы обнаружили пониженную резистентность lam1lam2lam3lam4 штамма к высокой (токсичной) концентрации NaCl в среде. Этот эффект наблюдался как на сбраживаемом (YPD), так и на слабосбраживаемом субстрате (с галактозой). Штамм со сверхэкспрессией LAM2 (PGAL-LAM2) напротив проявлял повышенную устойчивость к высоким концентрациям NaCl. 5. Было показано, что наблюдаемая нами при сверхэкспрессии LAM2 повышенная, а при нарушении совместном нарушении LAM генов пониженная устойчивость клеток S. cerevisiae к гиперосмотическому стрессу не является следствием изменения активации основного пути ответа на гиперосмотический стресс Hog-каскада. 6. На искусственных мембранах было показано, что повышенная концентрация NaCl (1М, условия осмотического стресса клеток дрожжей) ухудшает барьерную функцию модельной мембраны. Повышенная концентрация эргостерина способствовала сохранению барьерной функции. 7. Было показано, что ни нарушение lam1lam2lam3lam4, ни сверхэкспрессия LAM2 не приводит к изменению общего содержания стеринов в клетках. При этом содержание стеринов в плазматической мембране lam1lam2lam3lam4 выше, чем у дикого типа. 8. Мы обнаружили, что функция всех четырех LAM генов вырождена по отношению к некоторым стрессам. Было показано взаимодействие LAM2 гена c геном ERG5. Делеция ERG5 увеличивала резистентность дрожжей к амиодарону, однако делеция LAM2 гена отменяла этот эффект. Было показано, что нарушения LAM генов не приводят к изменению уровня экспрессии основного Osh белка Osh4p 9. Было показано, что нарушения LAM генов не приводят к изменению чувствительности клеток к цитотоксическим концентрациям азольных антимикотиков (Кетоконазол 50 мкг/мл, Клотримазол 35 мкг/мл, Миконазол 20 мкг/мл, Флуконазол 50 мкг/мл. Инкубация 3 часа при 30°С) при этом более устойчивы к цитостатическим концентрациям клотримазола 8 мкг/мл. Сравнение чувствительности lam мутантов с диким типом к амфотерицину действующему через связываение с эргостерином плазматической мембраны выявило повышенную чувствительность lam мутантов. Причем и к цитостатическим 1.6мкг/мл и к цитотоксическим 1.45мг/мл концентрациям амфотерицина В. Основной вклад в чувствительность к амфотерицину В вносит нарушение lam2 гена. Сверхэкспрессия LAM2, напротив, повышала устойчивость к амфотерицину В.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".