ИСТИНА

Основная роль белка Ku в клетке – его участие в репарации двухцепочечных разрывов в ДНК путем негомологического объединения концов и в V(D)J рекомбинации. Существует также большое число литературных свидетельств участия этого белка в транскрипционной регуляции клеточных и вирусных генов, включая регуляцию транскрипции одного из наиболее опасных вирусов – вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). При этом предполагается, что при транскрипции ВИЧ-1 Ku непосредственно взаимодействует с вирусным промотором, хотя механизм этого взаимодействия не установлен. Настоящий научный проект направлен на выяснение механизма регуляции транскрипции ВИЧ-1 гетеродимерным белком Ku. Дело в том, что гетеродимер Ku может эффективно связываться с концами двухцепочечной ДНК, однако его способность взаимодействовать с внутренними областями ДНК до сих пор однозначно не показана. При регуляции транскрипции Ku может либо связываться с промотором после внесения в него разрыва, либо каким-то образом взаимодействовать с неповрежденным промотором. Мы впервые предлагаем использовать синтетический ингибитор взаимодействия белка Ku с концами ДНК в качестве инструмента исследования участия этого белка в транскрипции ВИЧ-1. Выполнение проекта позволит нам получить характеристику молекулярного механизма взаимодействия Ku с промоторной областью провирусной ДНК. Мы сможем понять, происходит ли связывание Ku с промотором после внесения в него двухцепочечных разрывов под действием ДНК топоизомеразы IIβ или Ku связывается с неповрежденным промотором за счет ДНК-связывающего SAP-домена, расположенного на С-конце субъединицы Ku70. Помимо этого, созданная в ходе выполнения проекта серия новых ингибиторов в дальнейшем может быть использована для создания противораковых и, возможно, противовирусных препаратов с механизмом действия отличным от всех существующих на настоящий момент.

The primary role of Ku protein is reparation of DNA double-stranded breaks by non-homologous end joining and V(D)J recombination. There is a lot of literature facts that this protein also takes part in transcription regulation of cellular and viral genes, including the transcription regulation of human immunodeficiency virus (HIV-1), one of the most dangerous viruses of our times. It is also assumed that during the transcription of HIV-1 Ku directly interacts with the viral promoter, although the mechanism of this interaction is not installed. The present research project aims at the elucidation of the regulation mechanism of HIV-1 transcription by Ku protein. The fact that the Ku heterodimer’s ability to interact with internal regions of DNA is still not clearly shown. During the transcription regulation Ku can either contact with the promoter after the introduction of DNA break, or somehow interact with an intact promoter. We propose the use of synthetic inhibitor of Ku protein interaction with DNA ends as a tool to investigate the involvement of this protein in the HIV-1 transcription. The project will allow us to obtain the characterization of the molecular mechanism of Ku interaction with the promoter region of provirus DNA. We will be able to understand whether Ku binds the promoter after double-stranded breaks introducing by DNA topoisomerase IIβ or Ku is associated with an intact promoter due to DNA-binding SAP-domain located at the C-terminus region of the Ku70 subunit. In addition, the developed series of new inhibitors may be further used to create anticancer and, possibly, antiviral drugs with the new mechanism of action.

По окончанию проекта мы планируем получить следующие научные результаты: 1. Получить серию низкомолекулярных ингибиторов взаимодействия Ku с ДНК, более эффективных, чем описанный в литературе. 2. Определить, как гетеродимер Ku может взаимодействовать c внутренними участками ДНК. 3. Охарактеризовать взаимодействие Ku c ДНК-дуплексом с одноцепочечными разрывами, имитирующим структуру, образующуюся в результате интеграции ДНК ВИЧ-1 в геном клетки. 4. Выяснить механизм влияния Ku на транскрипцию с LTR промотора ВИЧ-1. 5. Установить, влияет ли топоизомераза IIβ на транскрипцию с LTR промотора ВИЧ-1 при отсутствии Tat и может ли происходить регуляция транскрипции с LTR ВИЧ-1 за счет совместного действия топоизомеразы и белка Ku.

В коллективе имеется опыт направленного органического синтеза веществ, необходимый для синтеза ингибитора STL127705 и его аналогов. В коллективе накоплен большой опыт работы с белком Ku. Также разработаны условия для бактериальной экспрессии в E.coli и последующей очистки белка Ku70 и гетеродимера Ku70/Ku80. Хорошо налажена методика сайт-направленного мутагенеза белков и получен набор делеционных мутантов Ku70. Методики большинства планируемых в работе экспериментов отрабатывались в лаборатории ранее, в том числе использование малых интерферирующих РНК для снижения внутриклеточных уровней Ku70 и Ku80. Более того, у нас имеются предварительные данные о том, что снижение внутриклеточных концентраций субъединиц Ku оказывает влияние на экспрессию гена люциферазы под контролем промотора LTR ВИЧ-1 в репортерной конструкции на основе вектора pGL3. Помимо этого, нами изучалась возможность взаимодействия рекомбинантного Ku со специфической последовательность NRE-1 из промоторной области GR-штамма вируса MMTV, фланкированной с обоих концов ДНК-шпильками и короткими дуплексами, предотвращающими «наползание» Ku со свободных концов ДНК. Оказалось, что Ku образует с такой ДНК несколько типов комплексов, однако пока нам удалось идентифицировать лишь те, которые Ku образует с короткими шпильками, а не специфической последовательностью. Мы предполагаем, что при использовании ингибитора STL127705 или его аналогов нам удастся дискриминировать комплексы Ku cо специфическими и неспецифическими последовательностями ДНК.

По итогам проекта получены следующие результаты: 1. Определено, что рекомбинантный гетеродимер Ku и клеточный Ku в лизате взаимодейcтвовуют с LTR ВИЧ-1 с закрытыми концами, по всей видимости, за счет участков с измененной вторичной структурой (шпилек) 2. С помощью молекулярного докинга обнаружен новый структурный класс ингибиторов взаимодействия Ku c ДНК, которые блокируют связывание рекомбинантного Ku c двухцепочечным олигонуклеотидом 3. По изменению количества фосфорилированной формы гистона H2AX было установлено, что одно из обнаруженных нами веществ в концентрации 25мкМ препятствует репарации двухцепочечных разрывов в культуре эукариотических клеток HEK 293T 4. Установлено, что узменение внутриклеточной концентрации топоизомеразы IIβ не оказывает влияние на транскрипцию с LTR промотора ВИЧ-1 при отсутствии Tat.