В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Изучение структурно-функциональных особенностей ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения и возможностей их практического использованияНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Изучение структурно-функциональных особенностей ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения и возможностей их практического использования
Результаты этапа: Проведен биоинформационный анализ генов ингибиторов протеолитических ферментов в доступных геномах мицелиальных грибов. Проведенная оценка показала, что представители четырех семейств ингибиторов (I34, I48, I79, I85) присутствуют только в грибных геномах, а пятое семейство, I66, в основном состоит из грибных ингибиторов. Наиболее широко представлены у грибов ингибиторы сериновой карбоксипептидазы Y из семейства I51, а также ингибиторы сериновых пептидаз субтилизинового типа из семейства I9. Ингибитор аспартильных пептидаз включает лишь семейство I34. Представители семейств I48 (ингибиторы цистеиновых эндопептидаз) и I85 (ингибиторы цистеиновых и сериновых пептидаз) связаны только с базидиомицетами, а представители семейств I34 (ингибитор сахаропепсина) и I79 (ингибитор цистеиновых пептидаз) – только с аскомицетами, причем ингибиторы из семейства I34 обнаружены пока только у дрожже-подобных грибов. В рамках задач проекта, связанных с поиском и детальным изучением новых внеклеточных ингибиторов пептидаз, секретируемых мицелиальными грибами, была проведена работа, связанная с выявлением и идентификацией ингибиторов пептидаз у представителей рода Trichoderma, являющихся сапротрофами. Препараты культуральной жидкости исследованных грибов снижали активность папаина, бромелаина и/или трипсина, но практически не ингибировали химотрипсин и субтилизин. Полученные в работе данные могут указывать на то, что найденные внеклеточные ингибиторы цистеиновых пептидаз, направлены не на регуляцию активности собственных ферментов, а выполняют скорее защитную роль от атаки экзогенных цистеиновых пептидаз чужеродных микроорганизмов. В текущем году проводили скрининг коллекций трансгенных растений табака с защитным геном ингибитора сериновых пептидаз из растений в составе векторных конструкций разного дизайна и их семенного потомства F1, F2 и F3. Недавно у 5 трансгенных линий табака получено потомство F4, которое будет анализироваться в 2016 г. Конструкции содержали либо 1 ген ингибитора сериновых пептидаз (ISP), либо тот же ген с двумя или четырьмя генами спидроина (белка паутины паука) в качестве энхансера в прямой и обратной ориентации. Все проанализированные линии демонстрировали наличие/сохранение трансгенной вставки в ряде поколений и экспрессию введенного целевого гена. В опытах in vitro сок контрольных растений в меньшей степени подавлял рост газона бактерий, чем сок трансгенных растений из всех групп. В настоящее время продолжается дальнейшее формирование коллекции трансгенных растений табака и арабидопсиса с векторными конструкциями различного дизайна и изучение экспрессии гетерологичных генов в полученных коллекциях трансформантов.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Изучение структурно-функциональных особенностей ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения и возможностей их практического использования
Результаты этапа: В рамках задач проекта, проводилось сравнительное биохимическое изучение вне- и внутриклеточных ингибиторов пептидаз мицелиальных грибов. Показано присутствие активности секретируемых и внутриклеточных ингибиторов протеолитических ферментов у грибов – представителей порядка Hypocreales. Показано, что у гриба T. cylindrosporum внеклеточные ингибиторы пептидаз были представлены низкомолекулярными ингибиторами бромелаина, папаина и трипсина, а также высокомолекулярным ингибитором субтилизина. В то же время у грибов того же порядка (различные виды Fusarium) были обнаружены внутриклеточные ингибиторы пептидаз, представленные, в основном, ингибиторами трипсина. Изучение возможной возможной функциональной роли вне- и внутриклеточных ингибиторов пептидаз грибов показало, что внеклеточные ингибиторы снижали активность пептидаз организмов из различных таксономических групп, при этом наибольший процент ингибирования отмечался для ферментов бактерий и насекомых. В противоположность секретируемым ингибиторам внутриклеточные ингибиторы трипсина, полученные из мицелия грибов F. avenaceum и F. graminearum, регулировали активность эндогенной трипсиноподобной пептидазы грибов, снижая активность на 80%. Таким образом, сравнительный анализ данных полученных при изучении секретируемых и внутриклеточных ингибиторов пептидаз грибов может указывать на наличие у них двух пулов ингибиторов пептидаз – один из которых внутриклеточный используется для регуляции активности собственных пептидаз грибов, а второй, включающий секретируемые ингибиторы пептидаз, используется грибом для защиты от конкурирующих патогенов. В связи с изучением ингибирующего действия ингибиторов пептидаз грибов на собственные и экзогенные протеолитические ферменты грибов проводилось также исследование некоторых секретируемых трипсиноподобных пептидаз фитопатогенных микромицетов рода Fusarium. Полученные данные могут указывать на большую функциональная значимость этих ферментов в процессах фитопатогенеза. Проведен сравнительный анализ семян разных поколений выборочной группы трансгенных растений, содержащих целевой ген ингибитора сериновых протеиназ из гречихи (ISP) в составе разных векторных конструкций. Показано, что трансгенная вставка присутствовала в большинстве проанализированных линий при длительном (более 10 лет) вегетативном размножении в ряде поколений, а также экспрессию введенного целевого гена в опытах in vitro. Анализ экспрессии введенного гена ингибитора показал, что экстракты всех трансгенных растений с геном ингибитора протеиназ в значительной степени подавляли прорастание спор гриба Aspergillus nidulans. В биотестах с первичными трансформантами, содержащими новые векторные конструкции, все исследованные растения превосходили контрольные по уровню антибактериальной активности в 1,5-3 раза как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий. В проанализированной части коллекции не выявлено прямого влияния количества и ориентации генов спидроина в трансформирующем векторе на уровень экспрессии целевого гена. Среди трансгенных растений как внутри одной группы, так и между группами с разными векторными конструкциями обнаруживаются как более устойчивые, так и более чувствительные варианты.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Изучение структурно-функциональных особенностей ингибиторов протеолитических ферментов различного происхождения и возможностей их практического использования
Результаты этапа: В рамках задач проекта, связанных с изучением новых ингибиторов протеолитических ферментов из растений с повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим стресс-факторам, а также ингибиторов секретируемых мицелиальными грибами, была проведена работа, связанная с идентификацией ингибиторов пептидаз в семенах однодольных и двудольных культур и у грибов, адаптированных к выживанию в разнообразных ситуациях. Обнаружено, что в ответ на стрессовые воздействия биотических и абиотических факторов среды у растений отмечается ответная реакция, характеризующаяся накоплением отдельных компонентов системы протеолиза и способствующая активации защитных механизмов и адаптации к новым условиям. Найдена тесная корреляционная связь между активностью индивидуальных ингибиторов пептидаз и устойчивостью растений к различным болезням. Показано, что в составе пула ингибиторов пептидаз в семенах высших растений имеются специальные ингибиторы, способные обеспечить защиту растений, а сами растения представляют собой хороший источник этих белков, разнообразных по специфичности и токсичных по отношению к поражающим их фитопатогенам. Ингибиторы, выполняющие защитные функции были выделены и идентифицированы на основании первичных и третичных структур, что позволило отнести часть из них к двум семействам – протеиназным ингибиторам картофеля 1 и к недавно предложенному нами новому семейству ингибиторов пептидаз гарпининам. В культуральных жидкостях грибов B. cinerea и Т. cylindrosporum обнаружены новые ингибиторы цистеиновых (папаина, бромелаина) и сериновых (химотрипсина у B. cinerea или трипсина и субтилизина у Т. cylindrosporum) пептидаз. Описаны некоторые их свойства и показано возможное участие ингибиторов Т. cylindrosporum в патогенезе личинок комаров. Продолжен скрининг длительно пассируемой без селективного давления коллекции асептических трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP. Впервые получена серия трансгенных растений табака с геном антимикробного пептида из дикого вида пшеницы Triticum kiharae и геном дефензина из звездчатки. Показано, что введение гетерологичных растительных генов разной природы, используемых растением в разных механизмах защиты от фитопатогенов, приводит к примерно одинаковому повышению фитопатогенной активности тканей трансгенных растений табака.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".