ИСТИНА

Разработка фундаментальных основ новых методов подавления популяций насекомых-вредителей является актуальной задачей, имеющей как теоретическое, так и практическое значение. Наиболее распространенные традиционные методы - обработка растений инсектицидами - позволяет значительно увеличить продуктивность сельскохозяйственных культур [1-3]. Существует мнение, что серьезной альтернативы инсектицидам на сегодня нет [4], так как они помогают сохранить 20% всего урожая [5]. Кроме этого, обработка инсектицидами позволяет снизить уровень заболеваемости растений заболеваниями, переносимыми насекомыми [6]. Однако, при использовании инсектицидов у насекомых со временем возникает генетическая устойчивость к препаратам. Приобретаемая устойчивость к инсектицидам ведет к увеличению доз препаратов и большему количеству обработок, и как результат – к повышению затрат и загрязнению окружающей среды [7]. Известны случаи, когда устойчивость членистоногих к инсектицидам успевает развиться еще в процессе испытания нового препарата, то есть до начала его промышленного производства [8, 9]. В связи с этим встает вопрос поиска альтернативных методов контроля насекомых-вредителей и поиску новых препаратов, устойчивость к которым развивалась бы не так быстро. Мишенью для действия таких препаратов могут стать консервативные участки матричных РНК генов насекомых. Если заблокировать трансляцию матричной РНК какого-либо функционально важного гена, то целевой белок не будет формироваться, что приведет к подавлению или гибели популяции насекомых. Например, используя антисмысловые олигонуклеотиды (АО) [10, 11], можно воздействовать на экспрессию матричной РНК. Если выбрать наиболее консервативную часть экзона функционально важного гена, то АО-инсектицид будет эффективно воздействовать на популяцию насекомого-вредителя длительное время. Перспективной группой препаратов являются инсектициды на основе длинных двухцепочечных фрагментов РНК [16, 17]. Инсектицидным эффектом также обладают короткие одноцепочечные фрагменты ДНК антиапоптозных генов вирусов ядерного полиэдроза насекомых, механизм действия которых пока неясен [12-15]. В основе идеи разработки и применения таких препаратов лежат методы посттранскрипционной блокировки экспрессии важных для жизни клеток генов насекомых с помощью механизмов РНК-интерференции [17, 18] и ДНК-интерференции [19], а также технологий применения антисмысловых олигонуклеотидов [10, 11]. Таким образом, блокировка процессов посттранскрипционной экспрессии генов является перспективным инструментом для контроля численности насекомых. Нашей лабораторией при Крымском федеральном университете имени В.И. Вернадского была установлена возможность успешного применения коротких одноцепочечных фрагментов ДНК антиапоптозных генов вирусов ядерного полиэдроза в качестве ДНК-инсектицидов в качестве средства защиты растений [12, 13]. Было показано, что короткие одноцепочечные фрагменты ДНК безопасны для других насекомых [14], а также растений [20]. Целью данного проекта является изучение фундаментальных механизмов действия ДНК-инсектицидов с целью улучшения их эффективности и оценки безопасности их применения. 1. Tilman D., Kenneth G. Cassman, Pamela A., Matson, Naylor R., Polasky S. Agricultural sustainability and intensive production practices // Nature. 2002. Vol. 418. P. 671?677. 2. Evenson R.E., Gollin D. Assessing the impact of the green revolution, 1960 to 2000 // Science. 2003. Vol. 300, № 5620. P. 758-762. 3. Soares W.L., De Sousa Porto M.F. Estimating the social cost of pesticide use: an assessments from acute poisoning in brazil // ECOL. ECON. VOL. 68, № 10. P. 2721-2728. 4. Webster J.P.G. Estimating the Economic Benefits of Alternative Pesticide Usage Scenarios: Wheat Production in the United Kingdom // Crop Production. 1999. Vol. 18. P. 83-89. 5. Oerke E.C., Dehne H.W. Safeguarding production losses in major crops and the role of crop protection // Crop Protection. 2004. Vol. 23. P. 275-285. 6. Ghosh A., Chowdhury N., Chandra G. Plant extracts as potential mosquito larvicides // Indian J. Med. Res. 2012. Vol. 135. P. 581-598. 7. Соколянская М. Резистентность насекомых к инсектицидам. Lambert academic publishing. 2012. 148 страниц. 8. Перегуда Т.А. Механизм устойчивости членистоногих к пиретроидам // Агрохимия. 1965. №8. C. 123-131. 9. Сундуков О.В. Резистентность вредителей сельскохозяйственных культур к пестицидам // Тр. ВИЗР. М., Агропромиздат. 1991. C. 59-64. 10. Weiss B., Davidkova G., Zhou L.W. Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes // Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55, № 3. P. 334-358. 11. Lu X., Yu Q., Binder G.K., Chen Z., Slepushkina T., Rossi J., Dropulic B. Antisense-mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) replication by use of an HIV type 1-based vector results in severely attenuated mutants incapable of developing resistance // J. Virol. 2004. Vol. 78, № 13. P. 7079-7088. 12. Oberemok V.V. Patent of Ukraine for useful model № 36445. “Method of elimination of phyllophagous insects from order Lepidoptera”. Applicant and patentee Taurida National V.I. Vernadsky University. № u 2008 0674; Decl. 19.05.2008; Publ. 27.10.2008. 13. Оберемок В.В. ДНК-маркеры в изучении взаимоотношений между вирусом ядерного полиэдроза и его хозяином непарным шелкопрядом: Автореф. дис. канд. биол. наук. К., 2011, 22 с. 14. Oberemok V.V., Skorokhod O.A. Single-stranded DNA fragments of insect-specific nuclear polyhedrosis virus act as selective DNA insecticides for gypsy moth control // Pesticide Biochemistry and Physiology. 2014. Vol. 113. P. 1-7. 15. Оберемок В.В., Зайцев А.С. Современные инсектициды: их преимущества, недостатки и предпосылки к созданию ДНК-инсектицидов // Ученые записки Таврического национального универ. им. В. И. Вернадского. Серия «Биология, химия». 2014. Т. 27 (66), № 1. С. 112–126. 16. Gu L., Knipple D.C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies // Crop. Protec. 2013. Vol. 45. P. 36–40. 17. Wang Y., Zhang H., Li H., Miao X. Second generation sequencing supply an effective way to screen RNAi targets in large scale for potential application in pest insect control // PLoS ONE. 2011. Vol. 6, № 4. P. e18644. 18. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. Vol. 391, № 6669. P. 806–811. 19. Kawai-Toyooka H., Kuramoto C., Orui K, Motoyama K., Kikuchi K., Kanegae T. Wada M. DNA interference: a simple and efficient gene-silencing system for high-throughput functional analysis in the fern Adiantum // Plant Cell Physiol. 2004. Vol. 45, № 11. P. 1648–1657. 20. Oberemok V., Nyadar P., Zaytsev O., Levchenko N., Shiyntum H., Omelchenko O. Pioneer Evaluation of the Possible Side Effects of the Dna Insecticides on Wheat (Triticum Aestivum L.) // International Journal of Biochemistry and Biophysics. 2013. Vol. 1(3). P. 57-63.

В ходе выполнения проекта получены следующие результаты: - оценена стабильность фрагментов ДНК в тканях насекомых - выявлена оптимальная длина фрагмента ДНК антиапоптозного гена бакуловируса, способная вызвать инсектицидный эффект - охарактеризовано влияние обработки насекомых ДНК-фрагментами антиапоптозного гена бакуловируса на уровень экспрессии отдельных апоптозных/антиапоптозных генов непарного шелкопряда, причем изучена будет как эпигенетическая, так посттранскрипционная регуляция экспрессии.