| Результаты этапа: 1) Выделение в чистую культуру изолятов гриба, поражающих растения семейства пасленовых. Пополнение коллекции изолятов.
За отчетный период коллекция была пополнена на 30 штаммов, выделенных из клубней полученных из Павинского р-на Костромская области, Уссурийского района (Приморский край), Якутского района Респ. Саха (Якутия), Йошкар-Олинском районе респ. Марий-Эл, Козельском районе Калужской области.
Выделение изолятов проводили в зимний период из склероциев на клубнях с использованием метода влажных камер. В чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной стерильной водой, на стекла, предварительно протертые спиртом, помещали очищенные от земли и нарезанные клубни картофеля. По прошествии периода от 2 до 5 дней производили выделение изолята гриба, для чего под бинокуляром препаровальной иглой отрывали черные склероции на поверхности клубней и помещали их на питательную среду (сусло-агар или овсяный агар) с добавлением пенициллина (бензилпенициллина натриевая соль, 1000 ед/мл). Чистые культуры выделенных изолятов помещали в коллекцию и хранили в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре +4°С.
Для отнесения выделенных изолятов к виду Rhizoctonia solani вначале проводили оценку микроскопических признаков (толщина и ветвление гиф), морфологию колоний и скорость роста на питательной среде (сусло-агар) при температуре, близкой к +25°С, а затем с применяли методы молекулярной идентификации.
2) Определение принадлежности штаммов к анастомозным группам.
Принадлежность к анастамозной группе чаще всего определяется путем попарного высаживания изолятов с тестерами различных анастамозных групп на питательную среду. Затем места соприкосновения мицелиев микроскопируют с целью выявления слияния гиф. Этот способ не отличается точностью. Поэтому был проведен анализ литературных данных и системы, описанные в литературе, были опробованы на ДНК коллекционных изолятов. В результате, эффективной оказалась система с праймерами PT1 и PT2 (Keiser, 2007), с помощью которой можно идентифицировать ДНК AG-3 анастамозной группы. Все коллекционные изоляты были протестированы с подобранными праймерами.
Анализ с праймерами PT1и PT2 позволил выявить штаммы, относящиеся к AG-3. Продукт ПЦР-амплификации имел длину около 400 п.н., наличие фрагмента на электрофореграмме позволяет отнести штамм к AG-3. Подавляющее большинство выделенных с клубней картофеля изолятов было отнесено к третьей анастомозной группе. ДНК 2х изолятов не образовывали ПЦР-фрагменты на электрофорезе. Впоследствии они были определены как AG-5 группа.
3) Определение вирулентности и агрессивности R. solani в отношении ростков картофеля.
Оценка агрессивности к картофелю (сорт «Волат») была проведена на выборке из 17 штаммов, выделенных из клубней российского и немецкого происхождения. Для этого в отдельную пробирку со стерильной водой помещали стебель картофеля длиной 15 см и агаризованный блок с мицелием тестируемого штамма. Эксперимент проводили в трех повторностях, впоследствии результаты усредняли. На шестые сутки оценивали интенсивность (по 5-балльной шкале: 0 – на стебле нет видимого мицелия, 5 – плотный слой мицелия по всей длине зоны поражения) и длину обрастания (в см) стебля мицелием изолята. Для получения показателя агрессивности показатели интенсивности и длины обрастания мицелия перемножали.
В тестах на стеблях картофеля исследованные изоляты различались по агрессивности. Наибольшие показатели были отмечены у устойчивых к фунгицидам штаммов R13M2PT1; R12S2PT7; R14VMrs6. Диапазон показателей поражения (балл обрастания умноженный на длину обрастания) варьировал от 0 (R12S2PT32, R13GDe8) до 36,13 (R13M2PT1).
4) Изучение генетической структуры коллекционных изолятов: секвенирование рибосомной ДНК.
Проведено секвенирование участка генома, традиционно используемого при идентификации видов базидиомицетов - региона ядерных рибосомных генов и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS).
Продукт ПЦР-амплификации ITS-региона с использованием праймеров ITS1 и ITS4 имел длину около 600 п.н. В результате исследования были определены нуклеотидные последовательности ITS регионов рДНК 65 штаммов. Филогенетический анализ полученных последовательностей методом Максимального правдоподобия выявил разделение изучаемых штаммов на несколько кластеров. Анализ последовательностей второго кластера и сравнение их с базой данных Генбанк определил принадлежность этих штаммов к AG-5 группе.
По сравнению со штаммами AG-3 нуклеотидные последовательности штаммов AG-5 группы имели ряд различий.
В полученных нуклеотидных последовательностях у большинства изолятов AG-3 было выявлено несколько (от 1 до 6) полиморфных пар оснований.
Внутри AG-5 группы также наблюдался полиморфизм. Штаммы различались наличием следующих замен: транзициями C→T в 135 позиции, A→G 375, T→C в 429, G →A в 543 и трансверсией A→C в 562.
5) Исследование устойчивости коллекционных изолятов к некоторым применяемым на картофеле фунгицидам.
В отчетном году было проведено изучение устойчивости возбудителя ризоктониоза к фунгицидам, используемым при обработке клубней перед посадкой и перед хранением.
В тестах, проводимых in vitro, оценивали устойчивость 57 изолятов R. solani к фунгицидам Максим, КС (действующее вещество (ДВ) - флудиоксонил, 25 г/л), Престиж, КС (имидаклоприд + пенцикурион, 140 + 150 г/л), Текто, КС (тиабендазол 500 г/л), Квадрис, КС (азоксистробин 250 г/л), Зерокс, ВР (коллоидное серебро 3г/л), Скор, КЭ (дифеноконазол 250 г/л).
Устойчивость грибов к фунгицидам оценивали в чашках Петри на среде с сусло-агаром с добавлением исследуемых препаратов в концентрациях действующего вещества 0,1; 1; 10; 100 мг/л и на среде без фунгицида (контроль). Изоляты R. solani, устойчивые к пенцикурону, дополнительно тестировали при концентрации фунгицида 1000 мг/л. Для оценки устойчивости к фунгициду исследуемый изолят высевали в центр чашки Петри и культивировали при температуре 24°С в темноте. Когда диаметр колонии гриба в контроле достигал 60-80 % от диаметра чашки Петри, проводили замер двух взаимно перпендикулярных радиусов всех исследуемых колоний. После измерений осуществляли усреднение по этим радиусам. Эксперименты выполняли в трёх повторностях, результаты также усредняли. Радиальный прирост колонии гриба пересчитывали в процентах относительно бесфунгицидного контроля. Для каждого изолята путем математической обработки определяли показатели EC50 (концентрация фунгицида, необходимая для замедления скорости радиального прироста колонии на 50 % относительно контроля).
Полученные результаты выявили, что эффективным фунгицидным действием в отношении R. solani обладали фунгициды флудиоксонил и пенцикурон. Величина показателя ЕС50 для флудиоксонила не превышала 0,09 мг/л по действующему веществу для всех исследованных штаммов. На начальном этапе флудиоксонил ингибировал рост R. solani, но при длительном культивировании (более 20 суток) на среде с его добавлением в концентрациях 10 и 100 мг/л образовывались устойчивые сектора. Более 90% исследованных штаммов были высокочувствительны к пенцикурону (ЕС50 не более 0,05 мг/л), однако были найдены 3 высокоустойчивых штамма, на которые пенцикурон практически не действовал (ЕС50 > 1000 мг/л). Коллоидное серебро в составе фунгицида Зерокс достаточно действенно подавляло рост колоний гриба (ЕС50 от 0,75 до 7,8 мг/л). Довольно высокую эффективность в ограничении радиального прироста колонии обнаружил дифеноконазол (ЕС50 от 4,2 до 69,7 мг/л) несмотря на то, что обычно данный препарат не используется для борьбы с ризоктониозом. Особо следует отметить высокую чувствительность исследованных штаммов R. solani к тиабендазолу (ЕС50 не более 8,5 мг/л). Этот фунгицид входит в состав протравителя Имикар, КС (имидаклоприд + тиабендазол, 280 + 80 г/л), используемого для обработки семенных клубней, и в состав широко используемых для обработки клубней во время хранения пирогенных шашек Вист (тиабендазол, 400 г/л).
Полевые опыты по изучению препаратов проводили на экспериментальном поле ВНИИ Картофельного Хозяйства (п. Красково, Люберецкий р-н, Московская область) в 2018 г. В полевых исследованиях использовали препараты Максим, Престиж, Селест Топ, КС (флудиоксонил + дифеноконазол + тиаметоксам, 262,5 + 25 +25 г/л), Зеребра Агро, ВР (500 мг/л коллоидного серебра + 100 мг/л полигексаметиленбигуанид гидрохлорида). Испытания проводились на 3х сортах: восприимчивом к ризоктониозу сорте Сантэ, устойчивом - Удача, и сорте Ильинский, об устойчивости которого нет данных.
Для фунгицидов оценивали показатель биологической эффективности (БЭ). На всех сортах в разные годы измерений наблюдалось сильное варьирование БЭ. На сорте Ильинский БЭ препарата Максим варьировала в годы исследований от 33,3 до 61,6%; на сорте Сантэ – от 25 до 81,5%. Препараты Зеребра Агро и Селест Топ на сорте Санте проявили очень высокую БЭ (90,8%) в засушливом 2018 году, в более влажные 2016 и 2017 годы она была значительно ниже. На сорте Удача в варианте с обработкой препаратом Престиж БЭ варьировала от 49,7 до 68,5%.
Таким образом, в результате работы по проекту впервые проанализирована коллекция российских изолятов возбудителей ризоктониоза, собранных из разных регионов России, и в том числе, выделенных из ранее неисследованных регионов – Респ. Саха, Приморского края.
По молекулярно-генетическим данным показана принадлежность выделенных изолятов к AG-3 и AG-5 анастамозным группам.
Впервые исследована восприимчивость российских изолятов R. solani к фунгицидам, применяемым на картофеле. Впервые были обнаружены устойчивые к пенцикурону и агрессивные штаммы.
О работах других российских научных групп, связанных с изучением развития видов рода Rhizoctonia на растениях семейства пасленовых, нам не известно.
6) Участие в международных научных конференциях.
Все участники проекта выступили с устными докладами, ознакомиться с перечнем которых можно в соответствующем разделе отчета.
7) Подготовка рукописей публикаций и их отправка в научные издания.
Опубликованы тезисы конференции «Ломоносов 2018»;
Опубликована статья «Популяции фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani J.G. Kühn на территории России» в сборнике Материалы Всероссийской конференции с международным участием, «Микология и альгология России. XX – XXI век: смена парадигм».
Подано в печать краткое сообщение об обнаружении агрессивных и устойчивых штаммов AG-5 анастамозной группы «First report of pencycuron resistant Rhizoctonia solani AG-5 strains on potato in Russia» в журнал Journal of Plant Pathology (WOS/Scopus);
Принята в печать статья «Эффективность фунгицидных препаратов в борьбе с ризоктониозом»;
Готовится к подаче в журнал публикация «Assessing the Russian potato Rhizoctonia solani population for sensitivity to fungicides and intraspecies diversity».
|
