ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
В настоящее время активно ведется работа по поиску и созданию генетически обусловленных животных моделей суправентрикулярных аритмий, однако таких моделей известно мало. В основном, исследователи, изучающие феномен фибрилляции предсердий, используют искусственные модели на животных – вызванные функциональными нарушениями или фармакологически обусловленные. Неоспоримым преимуществом возможных генетических животных моделей фибрилляции предсердий является то, что патология проявляется у большинства особей популяции, а нарушения ритма являются стабильными. В результате многолетних исследований нами была выявлена линия мышей, которая может потенциально использоваться как естественная генетически обусловленная модель суправентрикулярных аритмий. Данная линия мышей получена при скрещивании мышей линии C57Bl6 с линией CBA. Нами впервые было выявлено, что для гибридов F1 C57Bl6/CBA характерен такой исключительный феномен как спонтанная триггерная автоматическая активность в рабочем миокарде левого предсердия. Нами будут проведены дальнейшие исследования с применением передовых электрофизиологических, иммуногистохимических, поведенческих методов для выявления биоэлектрических особенностей функционирования миокардиальной ткани у данных животных. Наши исследования позволят получить не просто животную модель «суправентрикулярных аритмий», но «управляемую» модель, где присущая С57Bl6/CBA гибридам аритмогенная активность подавляется или индуцируется в заданный период онтогенеза.
Currently, investigation is actively carried out to create genetical animal models of supraventricular arrhythmias, but such models are few known. In general, researchers who study the phenomenon of atrial fibrillation apply artificial animal models - caused by functional disorders or by pharmacologically caused. The undeniable advantage of genetic atrial fibrillation models is that the pathology manifests itself in most individuals, and rhythm disturbances are stable. As a result of many years of research, we have identified a line of mice that can potentially be used as a natural genetically determined model of supraventricular arrhythmias. This line of mice was obtained by crossing C57Bl6 mice with the CBA line. We first discovered that F1 C57Bl6 / CBA hybrids are characterized spontaneous automatic activity in the working myocardium of the left atrium. We will conduct further studies using advanced electrophysiological, immunohistochemical, and behavioral methods for investigation of bioelectric functions of myocardial tissue in these animals. Our studies have made it possible to obtain animal model of "supraventricular arrhythmias".
1. В ходе выполнения работ по проекту будут впервые описаны и сравнены между собой биоэлектрические характеристики в препаратах различных участков миокарда у мышей линий C57Bl6 и CBA, потомства F1 C57Bl6/CBA и потомства F2 C57Bl6/CBA. Будет установлена возможная разница в длительности потенциалов действия, в значениях потенциала покоя, определена способность к формированию спонтанной триггерной активности не только в препаратах легочных вен, но и в препаратах левого предсердия. При выявлении спонтанной активности в препаратах левого предсердия (при отсутствии электрической стимуляции) будет впервые описан феномен возникновения триггерных автоматических паттернов в миокардиальной ткани предсердий у мышей. 2. Впервые будут получены данные о влиянии симпатического медиатора норадреналина на биоэлектрические характеристики миокардиальной ткани желудочка, левого предсердия и легочных вен у мышей линий C57Bl6 и CBA, потомства F1 C57Bl6/CBA, и потомства F2 C57Bl6/CBA. Будет описано влияние активации адренорецепторов на способность к формированию спонтанной активности в препаратах легочных вен и левого предсердия у всех трех поколений мышей. Также будут впервые получены данные о влиянии блокатора β-адренорецепторов (пропранолола), а также блокаторов калиевых каналов (дофетилида, Е-4021) на параметры потенциалов действия в стимулируемых препаратах, а также на характер спонтанной активности в нестимулируемых препаратах. Будет впервые проведено сравнение всех результатов по данным экспериментам между мышами трех последовательных поколений. 3. Будут получены данные о распределении в миокардиальной ткани желудочка, левого предсердия и легочных вен мышей основных транскрипционных факторов, характерных для эмбриональных кардиомиоцитов (Oct4, Nanog, SOX2, SSEA1). Полученные данные будут сопоставлены между мышами линий C57Bl6 и CBA, потомства F1 C57Bl6/CBA, и потомства F2 C57Bl6/CBA, а также с литературными данными о распределении данных факторов транскрипции у белых беспородных мышей. Будет сделан вывод об «эмбриональном» или зрелом фенотипе кардиомиоцитов в описываемых препаратах мышей. 4. Впервые будут сопоставлены данные по содержанию норадреналина в крови, плотности симпатических окончаний в миокардиальной ткани различных отделов сердца мышей трех последовательных поколений, а также данные по количеству выделяемого из симпатических терминалей норадреналина. По полученным данным будет сделан вывод о функциональном статусе симпатического отдела вегетативной нервной системы в целом организме. 5. Будет проведена регистрация ЭКГ у бодрствующих животных линий C57Bl6 и CBA, потомства F1 C57Bl6/CBA, и потомства F2 C57Bl6/CBA. Впервые будет проведен сравнительный анализ отличий параметров ЭКГ у животных трех последовательных поколений. Особое внимание будет обращаться на наличие признаков аритмогенной активности: отсутствие зубца Р во всех отведениях, нерегулярность длительности RR-интервала и изменения эквивалента QT-интервала. По результатам работы будут сделаны выводы о наличии и характере нарушений ритма у мышей трех последовательных поколений. 6. Будет проведен стандартный набор поведенческих тестов (тест «открытое поле», Т-образный лабиринт) для оценки психологических фенотипических различий, оценки уровня тревожности и активности животных. Впервые будет проведено сравнение поведенческих характеристик среди мышей трех последовательных поколений.
1. Нами было показано, что в изолированном препарате ушка левого предсердия мышей F1 C57Bl6/CBA при отсутствии электрической стимуляции в большинстве случаев наблюдается спонтанная автоматическая активность. Спонтанные потенциалы действия возникают через 10-60 секунд после прекращения стимуляции, имеют быстрый фронт, не имеют фазы медленной диастолической деполяризации. Стоит отметить, что при электрической стимуляции в препаратах ушка левого предсердия у данных мышей наблюдаются стандартные потенциалы действия, а значение потенциала покоя составляет -80±5 мВ. Также нами было выявлено, что стимуляция адренорецепторов приводит к видимому усилению спонтанной активности в ушке левого предсердия. В нормальных условиях при отсутствии стимуляции в препаратах изолированного ушка левого предсердия не наблюдается возникновение спонтанной активности. Из литературных данных известно, что возникновение спонтанных потенциалов действия в левом предсердии возможно только при патологиях. 2. Как и у многих млекопитающих у мышей F1 C57Bl6/CBA миокардиальная ткань легочных вен способна к формированию спонтанной активности, что и является одной из причин развития суправентрикулярных аритмий. Однако нужно отметить, что в отличие от других экспериментальных животных, в базальных условиях у мышей F1 C57Bl6/CBA спонтанная активность развивается практически сразу после прекращения электрической стимуляции препарата. Возникающие потенциалы действия имеют конфигурацию, стандартную для рабочих кардиомиоцитов, однако в половине экспериментов наблюдаются ранние или поздние постдеполяризации. В результате общая длительность потенциала действия увеличивается из-за снижения реполяризующих токов, однако при наличии постдеполяризации возникает преждевременный потенциал действия, что может послужить причиной развития фибрилляции предсердий.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 22 марта 2018 г.-19 марта 2019 г. | Изучение особенностей биоэлектрической активности миокардиальной ткани различных структур сердца мышей C57Bl6/CBA как потенциальной животной модели суправентрикулярных аритмий |
Результаты этапа: В соответствии с задачами, поставленными на 2018 год, при помощи стандартной микроэлектродной техники были исследованы параметры биоэлектрической активности в препаратах миокардиальной ткани желудочка, левого предсердия и легочных вен у трех поколений мышей: родительских особей линий C57Bl/6 (самцы) и CBA (самки), потомства F1 C57Bl/6/CBA, и потомства F2 C57Bl/6/CBA (все мыши были массой 25-40 г.). В работе были использованы 3 типа многоклеточных препаратов: легочные вены (ЛВ), ушко левого предсердия (ЛП) и правый желудочек (ПЖ). Следует отметить, что в работе нами был использован препарат правого желудочка, а не левого, как изначально было заявлено в проекте, по причине нежизнеспособности препарата левого желудочка в условиях нашего эксперимента. Изначально было проведено несколько экспериментов на препаратах левого желудочка, но зарегистрировать в нем ПД нам не удалось. Препараты работали в двух режимах: (1) в навязанном ритме (при электрической стимуляции - частота 5 Гц, длительность импульса - 2 мс, амплитуда - 3-10 В) и (2) без стимуляции, такие препараты называли «покоящимися». Указанные два режима работы тканевых препаратов моделируют (1) «естественные» условия, когда ткань находится под ритмическим контролем ритмоводителя, а также (2) «патологические» условия, когда возбуждение ткани импульсами ритмоводителя заблокировано. В стимулируемых препаратах оценивали значения длительности потенциалов действия на уровне 90 и 50% реполяризации (ДПД90% и ДПД50%) а также значения потенциала покоя (ПП), в нестимулируемых - значения ПП, а также наличие и характер спонтанной активности. Значения ДПД90% и ДПД50% в электрически стимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей трех поколений (линий C57Bl/6 и CBA – родительские особи, потомства F1 C57Bl/6/CBA и потомства F2 C57Bl/6/CBA) представлены в таблицах 1-1, 1-2. Нами не было выявлено статистически значимых различий в значениях ДПД в миокарде ЛВ (ЛП/ПЖ) между различными типами мышей. Также мы регистрировали значения ПП как в стимулируемых, так и в покоящихся препаратах миокарда ЛВ, ЛП и ПЖ. В стимулируемых препаратах миокарда ЛВ всех трех поколений мышей не было обнаружено статистически значимых различий в значениях ПП: у мышей линии C57Bl/6 он составил -79±4 мВ (n=4), у мышей линии CBA -78±2 мВ (n=5), у гибридов первого поколения F1 -75±3 мВ (n=5), у F2 -78±2 мВ (n=5). При отключении стимуляции деполяризацию потенциала покоя наблюдали у мышей линии CBA, в этом случае ПП достигал значений -67±2 мВ (n=5), а также в части препаратов (3 из 5) мышей линии C57Bl/6 (родительские особи, самцы). В среднем ПП в ЛВ мышей линии C57Bl/6 достигал значений-73±3 мВ (n=5). У мышей гибридов F1 и F2 такой спонтанной деполяризации не наблюдали. ПП у них составил-75±2 мВ (n=4), -75±3 мВ (n=5) и -76±2 мВ (n=5), соответственно (Рис.1-1). В стимулируемых препаратах ЛП мышей всех трех поколений не было выявлено статистически значимых различий в значениях ПП (Рис. 1-2): у мышей линии C57Bl/6 он составил -79±5 мВ (n=5), у мышей линии CBA -79±3мВ (n=5), у гибридов первого поколения F1 -75±4 мВ (n=10), у F2 -77±2 мВ (n=4). В покоящихся препаратах левого предсердия ПП статистически значимо отличался (от соответствующих значений в стимулируем препаратах) только у мышей линии CBA: он достигал значений -69±2 (n=5). В остальных случаях ПП оставался стабильным и составил у мышей линии C57Bl/6 -78±5 мВ, у гибридов F1 -72±6 мВ (n=9), у F2 -73±7 мВ (n=4). Таким образом, в препаратах ЛП только мышей линии СВА мы наблюдали спонтанную деполяризацию ПП. В стимулируемых препаратах ПЖ, так же, как и в нестимулируемых препаратах не наблюдали никаких статистически значимых различий в значения ПП между мышами трех поколений (Рис. 1-3). Таким образом, в данном типе препаратов у всех поколений мышей потенциал покоя был стабильным и не подвергался спонтанной деполяризации после отключения ритмической стимуляции препарата. Таким образом, нами впервые был проведен сравнительный анализ значений ПП в стимулируемых и нестимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей трех поколений. В покоящихся препаратах ЛВ родительских особей (мышей линий C57Bl/6 и СВА) наблюдали характерную для большинства изученных млекопитающих деполяризацию ПП, тогда как у гибридов F1 и F2 ПП оставался гиперполяризованным. Возможно, это обусловлено различным уровнем экспрессии каналов, переносящих ток IK1, который определяет уровень потенциала покоя. На следующем этапе нашей работы мы определяли способность к формированию спонтанной автоматической активности в нестимулируемых препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ у мышей всех трех поколений мышей в базальных условиях, то есть без действия каких-либо веществ (обобщенные данные приведены в таблице 1-3). Мы выяснили, что в покоящихся препаратах ЛВ регулярная спонтанная активность развивалась у всех видов мышей, кроме материнских особей линии CBA, однако, в отличие от гибридов F1 и F2, у мышей линии C57Bl/6 такая спонтанная автоматическая активность развивалась крайне редко. Кроме того, у мышей F1 и F2 такие спонтанные ПД в части экспериментов сопровождались ранними постдеполяризациями (Рис. 1-4). Спонтанная автоматическая активность развивалась в течение 10-60 с после прекращения стимуляции препарата и поддерживалась на протяжении всего времени отсутствия стимуляции. В покоящихся препаратах ЛВ мышей линии C57Bl/6 в 40% случаев (n=5) развивалась спонтанная автоматическая активность (в одном из этих препаратов наблюдали ПД с ранними постдеполяризациями), при этом ПП оставался на гиперполяризованном уровне, а в остальных 60% препаратов наблюдалась спонтанная деполяризация потенциала покоя без развития какой-либо активности. У гибридов F1 спонтанная автоматическая активность развивалась в 80% препаратов ЛВ, 55% из них имели ПД с ранними постдеполяризациями. У гибридов F2 спонтанная автоматическая активность развивалась в 90% случаев (n=6), в 60% из которых наблюдали ПД с постдеполяризациями. У мышей линии СВА при прекращении стимуляции наблюдали исключительно развитие деполяризации ПП, без формирования какой-либо регулярной автоматической активности. В покоящихся препаратах ЛП мышей наблюдали развитие спонтанной автоматической активности у всех типов мышей, кроме материнских особей линии СВА (Рис.1-5). Однако у мышей линии C57Bl/6 такая активность возникала реже, чем у гибридов F1 и F2: только в 50% препаратов (n=6), тогда как у гибридов F1 и F2 в 80% препаратов (n=18 и n=6, соответственно). Такая активность возникала либо сразу после прекращения стимуляции, либо в течение первых 60 сек и сохранялась на протяжении всей записи, то есть во время всего периода отсутствия электрической стимуляции. Кроме того, в некоторых случаях у мышей F1 C57Bl/6/CBA спонтанные ПД сопровождались постдеполяризациями (в 4 препаратах из 14). В покоящихся препаратах ПЖ нами также была обнаружена спонтанная автоматическая активность, причем у всех типов мышей (в 80% препаратов каждого из типов мышей). Спонтанные потенциалы действия появлялись сразу после прекращения стимуляции, имели регулярный характер и поддерживались на протяжении всего периода отсутствия стимуляции. Частота такой спонтанной активности была от 4 до 8 Гц. Возможно возникновение такой активности связано с тем, что в препаратах ПЖ содержатся элементы проводящей системы сердца, которые при определенных условиях могут генерировать собственный ритм, поэтому такая активность не рассматривалась нами как эктопическая. Таким образом, нами было впервые показано, что миокард не только ЛВ, но и ЛП гибридов F1 C57Bl/6/CBA, а также гибридов F2 C57Bl/6/CBA склонен к эктопической автоматии и/или аномалиям реполяризации ПД триггерного характера, служащим обычно основой формирования ФП у крупных млекопитающих и человека. Согласно нашим представлениям и данным литературы, спонтанная активность и аномалии реполяризации ПД в нормальных условиях (то есть без адренергической/симпатической стимуляции) ранее не были показаны ни для одной из линий мышей. Для оценки влияния адренергической стимуляции на способность к формированию спонтанной активности в препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ мы использовали норадреналин (НА – неселективный агонист адренорецепторов) а также блокатор β-адренорецепторов пропранолол (5 мкМ). Препараты в отсутствие стимуляции перфузировали раствором, содержащим 10 мкМ НА в течение 10-15 минут, регистрировали изменения мембранного потенциала в течение всего времени записи. Обобщенные данные по характеру действия НА на препараты ЛВ, ЛП и ПЖ у трех поколений мышей представлены в таблице 1-3. В препаратах ЛВ всех исследуемых типов мышей НА вызывал перманентную (сохраняющуюся на протяжении всего эксперимента) спонтанную активность регулярного или пачечного характера. В том случае, если в препаратах ЛВ исходно присутствовала спонтанная автоматическая активность, действие НА приводило к изменению характера следования ПД и увеличению частоты. То есть, например, если изначально, в базальных условиях в препарате наблюдали спонтанную автоматическую активность регулярного характера, то при действии НА она приобретала пачечный характер. Возникновение ПД с ранними постдеполяризациями при действии НА не было обнаружено, даже если они присутствовали изначально (Рис. 2-1, табл 1-3.). В препаратах ЛП у мышей линии C57Bl/6, гибридов F1 C57Bl/6/CBA и F2 C57Bl/6/CBA действие НА либо приводило к возникновению спонтанной активности в тех препаратах, в которых ее не было изначально, в базальных условиях, либо вызывало изменение характера спонтанной автоматической активности (Рис. 2-1, Табл. 1-3). В покоящихся препаратах мышей линии CBA НА ни в одном из препаратов не вызывал спонтанной активности, а также не приводил к каким-либо изменениям мембранного потенциала. В препаратах ПЖ у всех трех поколений мышей НА действовал сходно: он вызывал спонтанную активность в том случае, если ее не было изначально, и изменял характер и частоту спонтанной автоматической активности, когда она была изначально в покоящихся препаратах. В ходе выполнения работ по проекту нами также был использован блокатор β-адренорецепторов (пропранолол, 5 мкМ), его подавали на фоне НА в течение 5-10 минут. Во всех типах препаратов у всех трех поколений мышей пропранолол действовал одинаково: он полностью блокировал действие НА. То есть он приводил либо к полному прекращению спонтанной активности, вызываемой НА (в случае, если изначально в базальных условиях в препаратах не было спонтанной автоматической активности), либо к изменению характера и частоты спонтанной активности с тех, которые были при действии НА на те, которые были изначально в базальных условиях. На следующем этапе работы оценивали действие селективных блокаторов hERG K+ каналов, переносящих ток IKr (дофетилид, 5 нМ, являющийся антиаритмическим препаратом III класса, и Е-4031, 5 нМ) на спонтанную активность, вызываемую норадреналином в покоящихся препаратах (1), а также на параметры ПД в стимулируемых препаратах (2) ЛВ, ЛП и ПЖ всех типов мышей. 1. Ни один из блокаторов не влиял на параметры спонтанной активности, вызываемой НА ни в одном из типов препаратов у всех трех поколений мышей. 2. Также ни дофетилид, ни Е-4031 значимо не изменяли ДПД90% и ДПД50% ни в одном из типов препаратов у всех трех поколений мышей. Исходя из таких результатов можно заключить, что у мышей линий C57Bl/6 и СВА, а также у гибридов F1 C57Bl/6/CBA и F2 C57Bl/6/CBA ток IKr, характерный для неонатального миокарда грызунов, не сохраняется у взрослых мышей изучаемых типов и не вносит значимого вклада в формирование спонтанной активности, а также в конфигурацию ПД в препаратах ЛВ, ЛП и ПЖ. В соответствии с планом работ на следующем этапе нами были проведены эксперименты по регистрации ЭКГ у мышей линий C57Bl/6 и CBA, потомства F1 C57Bl/6/CBA, и потомства F2 C57Bl/6/CBA. ЭКГ регистрировали с помощью поверхностных электродов, подключенных к усилителю PL3516 PowerLab 16/35, Animal Bio Amp (IDInstruments, USA) в отведении, эквивалентном II отведению по Эйнтховену. Запись и анализ сигнала осуществляли при помощи программного обеспечения LabChart Pro (IDInstruments, USA). При анализе ЭКГ оценивали следующие параметры: ЧСС (частота сердечных сокращений, уд/мин, рассчитывали на основе длительности RR-интервалов); RMSSD - показатель, характеризующий вариабельность ритма, с помощью данного показателя можно выявить нерегулярность длительности RR-интервала; длительность Р зубца (мс), который отражает время деполяризации предсердий; интервал PR (мс), соответствующий общему времени атрио-вентрикулярного проведения; QRS (мс) – время, деполяризации желудочкового миокарда; интервал QT (мс), соответствующий продолжительности деполяризации желудочкового миокарда. Также оценивали наличие или отсутствие нарушений ритма. Соответствующие результаты представлены на рис. 3-1. Статистически значимых различий в значениях ЧСС у мышей всех трех поколений обнаружено не было. Так, у мышей линии C57Bl/6 ЧСС составила 560±44 уд/мин (n=4), у мышей линии CBA 584±32 уд/мин (n=5), у F1 C57Bl/6/CBA 596±43 уд/мин (n=8), и потомства F2 C57Bl/6/CBA 610±43 уд/мин (n=4). В значениях таких параметров ЭКГ, как RMSSD, длительность QRS комплекса, длительность QT интервала статистически значимых различий между исследуемыми типами мышей также обнаружено не было (данные представлены на рис.3-1). Статистически значимые различия были обнаружены только в длительности Р зубца между мышами линии C57Bl/6 и гибридами F2 C57Bl/6/CBA (17,6±2 мс (n=4) и 11,9±2 мс (n=4), соответственно), а также в длительности PR-интервала. Так, у мышей линии C57Bl/6 она составила 47,1±4 мс (n=4), что статистически значимо отличалось от значений данного параметра у других типов мышей: мышей линии СВА - 35,6±3 (n=5), F1 C57Bl/6/CBA - 34,3±2 (n=8), F2 C57Bl/6/CBA - 38,6±3(n=4). Однако данные различия не являлись критическими. Следует отметить, что в наших экспериментах ЭКГ у всех типов мышей не имела ярко выраженных изменений и отклонений от нормы, каких-либо нарушений ритма: во всех записях были видны зубец P, QRS-комплекс и T волна. Возможно, что эктопическая автоматия оказывается подавлена при ритмическом воздействии со стороны пейсмекера сердца, и не проявляется у здоровых животных без дополнительных патологических воздействий. | ||
2 | 26 июня 2019 г.-10 марта 2020 г. | Изучение особенностей биоэлектрической активности миокардиальной ткани различных структур сердца мышей C57Bl6/CBA как потенциальной животной модели суправентрикулярных аритмий |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Файл, содержащий рисунки, отражающие основные результаты работы по проекту | Prilozhenie_1__fajl_s_risunkami.pdf | 1,1 МБ | 27 марта 2020 [karimovaVika] |