ИСТИНА

Основной целью проекта является разработка методов, позволяющие анализировать распределение различных эпигенетических сигналов (метилированные остатки цитозина, метилированные формы гистонов) в любом компартменте генома с высоким разрешением и высокой производительностью. Полученные при реализации проекта результаты послужат основой для анализа эпигенетических механизмов возникновения онкологических заболеваний и создания эффективных и относительно быстрых и недорогих методов их ранней диагностики. При этом разработанные методы будут носить универсальный характер и могут быть использованы при изучении эпигенетических механизмов любых заболеваний, возникновение которых связано с изменением экспрессии определенных компартментов генома.

Разработан альтернативный метод получения обогащенных фракций генома с помощью биотинилированных по 5’-концу однонитчатых ДНК-зондов. В отличие от существующих коммерческих систем, ориентированных в основном на задачи глубокого секвенирования ДНК, данный метод работает на нативной геномной ДНК без ее промежуточной амплификации и поэтому позволяет анализировать распределение метилированных остатков цитозина. При использовании биотинилированных зондов умеренной длины (сотни нуклеотидов) и высокополимерной ДНК-мишени удается получать фракции, обогащенные полными последовательностями генов, поскольку для их связывания с зондом достаточно гибридизации не по всей длине последовательности-мишени, а по ее относительно небольшому участку. Оптимизирована процедура получения биотинилированных зондов и исследована эффективность процедуры обогащения в зависимости от длины зонда, способа его очистки и метода гибридизации. Разработана оптимальная схема, позволяющая получать фракции ДНК, обогащенные целевыми генами в десятки-сотни раз, даже при использовании одного зонда на участок ДНК в 5000-10000 нуклеотидов. Метод намного экономичнее существующих коммерческих систем и не требует использования систем высокоэффективного параллельного синтеза олигонуклеотидов in situ и другого труднодоступного и дорогостоящего оборудования. Он естественным образом (без дополнительных усилий и затрат) обеспечивает возможность селективного обогащения отдельно по каждой из комплементарных нитей ДНК, что имеет важное значение при анализе эпигенетических меток. Отработана методика анализа метилирования остатков цитозина в полученных обогащенных фракциях ДНК на платформе высокопроизводительного параллельного секвенирования GAIIx фирмы Illumina. Она состоит из трех основных этапов. На первом обогащенные образцы (представляющие собой смеси однонитчатых молекул ДНК) обрабатываются бисульфитом натрия с помощью набора Qiagen EpiTect Bisulfite Kit по прописи, рекомендуемой для малых количеств ДНК. На втором, очищенные продукты бисульфитной обработки подвергаются полногеномной амплификации с помощью набора Qiagen EpiTect Whole Bisulfitome Kit (естественно, можно ипользовать любой другой набор для бисульфитной модификации или «домашнюю» систему, но мы не знаем, существуют ли аналоги набора Qiagen EpiTect Whole Bisulfitome Kit). На третьем этапе осуществляют подготовку библиотек фрагментов для секвенирования на геномном анализаторе GAIIx с помощью реактивов фирм NEB и Illumina стандартными методами. И в этом случае вполне возможно использование альтернативных наборов для подготовки библиотек. При этом используется мультиплексирование: на каждой дорожке оптической ячейки для секвенирования можно проанализировать несколько десятков образцов. Для доказательства работоспособности разработанного метода в реальной ситуации мы проанализировали характер метилирования группы локусов (около 20 штук) генома человека, предположительно являющихся горячими точками гиперметилирования при плоскоклеточной форме рака легких. Набор целевых локусов формировали по результатам анализа литературы и валидировали с помощью альтернативных методов анализа метилирования ДНК: иммунопреципитации метилированной ДНК с помощью специфических антител к 5-метилцитозину (MeDIP) с последующим анализом гибридизацией на микрочипах фирмы Roche-NimbleGen и классическим методом ПЦР-амплификации участков генома после обработки ДНК бисульфитом натрия с последующим секвенированием по Сэнгеру. В качестве источника ДНК для анализа метилирования использовали образцы опухолевой ткани трех пациентов с плоскоклеточной формой рака легких и контрольные образцы нормальной ткани легких этих же пациентов. Показано, что с помощью разработанного нами метода можно анализировать характер метилирования довольно обширных групп локусов генома на платформе Illumina при высокой степени мультиплексирования. Таким образом, метод позволяет анализировать характер метилирования произвольного набора локусов (например, горячих точек гиперметилирования) в большом количестве образцов при весьма умеренных затратах времени, труда и реактивов. Следует подчеркнуть, что разработанный нами метод носит универсальный характер и может быть легко адаптирован для очень разных задач. Во-первых, он позволяет анализировать не только характер метилирования целевых последовательностей ДНК, но и собственно их структуру (точечные полиморфизмы, инсерции-делеции и другие формы изменчивости). Во-вторых, метод пригоден для изучения генома не только человека, но и любого другого организма, для которого известна нуклеотидная последовательность (не обязательно полная!), достаточная для конструирования олигонуклеотидных праймеров для синтеза биотинилированных ПЦР-зондов. В-третьих, метод может быть использован для исследований в области метагеномики, например, для изучения популяций микроорганизмов в различных экологических нишах, изменчивости микробиомов у человека и животных и т. п. Наконец, метод может быть легко адаптирован под любую платформу секвенирования.