ИСТИНА

Фиробласт-миофибробластная дифференцировка – процесс, необходимый для нормального эмбриогенеза. У взрослых организмов она обеспечивает процессы заживления ран, и регенерации хрящевой ткани при ее повреждении. С другой стороны, она является причиной фиброзов внутренних органов. В ряде моделей in vivo и in vitro показано, что многие стрессы, в том числе окислительный, индуцируют миофибробластную дифференцировку. В рамках проекта мы планируем исследовать модулирующее действие антиоксидантов, селективно элиминирующих митохондриальные активные формы кислорода (АФК), на эти процессы. Ранее мы обнаружили, что синтезированные в отделе В.П. Скулачева антиоксиданты, специфически направленные в митохондрии (названные SkQ), индуцируют морфологические изменения, характерные для миофибробластной дифференцировки. Предварительные данные позволяют нам предположить, что механизм индукции дифференцировки SkQ включает повышение уровня экспрессии или активации ряда цитокинов, в частности TGF. В рамках проекта планируется проверить это предположение, а также исследовать механизм индукции цитокина (предположительно TGF) аналогами SkQ1. Способность антиоксидантов, направленных в митохондрии к индукции превращения фибробластов в миофибробласты может стать серьезным препятствием для их предполагаемого использования в клинической практике из-за возможности возникновения у пациентов фиброзов. Мы планируем исследовать молекулярные механизмы индукции наблюдаемой нами дифференцировки в разных клеточных системах с нормальным и избыточным содержанием АФК, а также в системах in vivo с тем, чтобы получить возможность регулировать эту «дифференцировочную» активность SkQ. В то же время способность митохондриально направленных антиоксидантов к индукции миофибробластной дифференцировки и вероятной генерации/активации TGF может быть использована при лечении ран различного происхождения (диабетических, гнойных, асептического воспаления). Такая возможность будет проверена в экспериментах по исследованию влияния антиоксидантов на подвижность клеток в разных системах in vitro, а также в моделях зарастания ран in vivo.

Известно, что активные формы кислорода (АФК) участвуют в передаче сигналов перестройки цитоскелета и дифференцировки фибробластов. Для изучения этих сигнальных путей мы использовали новый митохондриально-направленный антиоксидант, пластохинон, коньюгированный с децилтрифенилфосфонием (SkQ1). Мы обнаружили, что SkQ1, понижая уровень митохондриальных АФК, приводит к усиленному образованию актиновых стресс фибрилл. Классические антиоксиданты N-ацетилцистеин (NAC) и Trolox, вызывают аналогичный эффект в концентрациях на несколько порядков выше, чем SkQ1. SkQ1 вызывает возрастание экспрессии маркеров миофибробластной дифференцировки (EDA изоформы фибронектина и гладкомышечного актина альфа) в первичных человеческих подкожных фибробластах. Было показано, что этот эффект опосредуется трансформирующим фактором бетта 1 (TGFb1), который активируется в культуральной среде металлопротеазой 9 (MMP9). Миофибробластный фенотип поддерживается в культурах в течение длительного времени (до 3 месяцев) после удаления SkQ1 за счет аутокринной петли с участием TGFb1. Мы показали, что кофилиновая система участвует в индуцированных SkQ1 изменениях структуры и динамики актинового цитоскелета. Мы обнаружили, что через 15 часов после добавления, SkQ1 вызывает возрастание (1,5-7 раз в разных опытах) уровня фосфокофилина по сравнению с кофилином. Возрастание уровня фосфокофилина под действием SkQ1 предшествовало существенным изменениям актинового цитоскелета, которые наблюдались через 7 дней и тенденция к которым прослеживалась уже через 1-3 суток после добавления антиоксиданта. Важно отметить, что другие испытанные нами антиоксиданты (Trolox, NAC) также индуцировали возрастание уровня фосфорилирования кофилина в HSF, что свидетельствует об общем механизме действия антиоксидантов на динамику актина. Баланс фосфокофилин/кофилин поддерживается в клетке за счеTGFb1, который способен быстро (5-15 мин) активировать и другие сигнальные пути, в том числе MAPK сигналинги, Ras, Rho-like (Rho, Rac, cdc42), PP2A. Эти сигналинги поддерживают SMAD сигналинг, а также имеют не зависимые от экспрессии белков эффекты, такие как перестройка цитоскелета. Полученные на культурах клеток данные позволили предположить, что SkQ1 может оказывать стимулирующее действие на заживление кожных ран у животных. Было показано, что SkQ1 стимулирует заживление резаной полнослойной кожной раны у мышей и крыс. Применение SkQ1 в различных лекарственных формах в наномолярных дозах ускоряет очищение ран от детрита. На ранних сроках (7 ч) SkQ1 снижает нейтрофильную инфильтрацию раны. Под действием SkQ1 на ранних стадиях регенерации ускоряется созревание грануляционной ткани и увеличивается содержание в ней миофибробластов, что приводит к накоплению коллагеновых волокон на более поздних сроках. Местное применение SkQ1 ускоряет эпителизацию ран. Длительный прием SkQ1 с водой значительно ускоряет заживление ран у старых (28-месячных) мышей и у диабетических мышей. В модели раны in vitro SkQ1 ускоряет движение эпителиоцитов и фибробластов в «рану» и стимулирует миофибробластную дифференцировку подкожных фибробластов человека. Предполагается, что SkQ1 стимулирует ранозаживление благодаря подавлению негативных последствий окислительного стресса, возникающего в ране, а также благодаря индукции процессов дифференцировки.