Взаимоотношения ржавчинного гриба Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb. с личинками галлиц-мицетофагов Mycodiplosis pucciniae (Pritchard, 1948).
Малеева Ю.В., Головачев Я.А., Шилович А.А., Ивницкий С.Б.
Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова
Москва

Исследование взаимоотношений ржавчинных грибов с насекомыми-мицетофагами важны как для понимания экологии сложных естественных сообществ, так и для разработки биологических методов борьбы с этими фитопатогенами в агроценозах. 
Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb. – разнохозяйственный ржавчинный гриб из семейства Coleosporiaceae. Основной хозяин - сосна, на иглах которой развивается зимующий мицелий на эцидиальной стадии. При этом урединио- и телио- стадии гриба могут развиваться на нескольких видах цветковых растений, в том числе на мать-и-мачехе и крестовнике. В течение лета гриб дает несколько поколений урединиоспор в коротких цепочках. Телейтопустулы появляются во второй половине лета и прикрыты эпидермисом.
Мицетофагия широко распространена у насекомых. Примером могут быть свободноживущие галлицы Mycodiplosis pucciniae – мелкие комарики (Diptera, Cecidomyiidae), личинки которых не образуют галлов, а открыто живут на листьях растений и питаются преимущественно спорами ржавчинных грибов. Это представители эфемеров, жизненный цикл которых занимает около недели, и естественный отбор идет по темпам роста (Мамаев, Кривошеина, 1965). Митохондриальный геном этих мелких (до 1мм) насекомых очень компактен, обогащен перекрывающимися генами, белок-кодирующие гены отличаются небольшими размерами, а одной из задач обнаруженного здесь редактирования тРНК, верояно, является исправление ошибок, возникающих при высокой скорости репликации генома (Beckenbach, Joy, 2009). Данное семейство относится к низшим Двукрылым, для которых известно, что они исходно сформировались в околоводных биотопах с гниющими растительными остатками, перерабатывать которые этим личинкам с внешним типом пищеварения помогали грибы. Возраст этой группы – более 150 млн. лет.
Галлицы-мицетофаги группы Mycodiplosis pucciniae - сложный комплекс меж- и внутривидовых форм двукрылых, тесно связанных с разнообразием растений-хозяев. Взрослые насекомые не питаются и живут 2-3 суток, поэтому дивергенция в группе обеспечивается особенностями питания личиночной стадии насекомых. В данном случае дивергенция связанна с расхождением по разным видам ржавчины – непосредственного пищевого субстрата личинок. Изучение особенностей пищевых предпочтений в популяциях этих насекомых и закономерностей возникновения специализации имеет большое значение для понимания формирования сложных коэволюционных взаимоотношений и механизмов диференциации видов. При этом, личинки насекомых-мицетофагов в свою очередь являются фактором, регулирующим развитие и распространение ржавчинного гриба. Они переносятся по воздуху со спорами ржавчины на новые растения, питаются спорами ржавчины за счет внекишечного пищеварения.  На поздних стадиях сукцессии при достаточной влажности к этому комплексу добавляются микофильные грибы, обладающие с одной стороны мощным индуцибельным спектром гидролитических ферментов, а с другой – секретируемыми во внешнюю среду токсинами.
Вопрос о специализации насекомых из этой малоизученной группы по отношению к растениям-хозяевам и развивающимся на них видам-прокормителям ржавчинных грибов остается открытым. Одни исследователи относят всех галлиц, личинки которых питаются спорами ржавчинных грибов, к виду M. pucciniae. Например, такие представления отражены в классической систематической сводке по морфологии личинок галлиц (Мамаев, Кривошеина, 1965). Другие сильно дробят вид в зависимости от гриба-прокормителя, активно используют молекулярные признаки (например, Nelsen, 2013). Рибосомные ITS-спейсеры, ранее продемонстрировавшие свою эффективность для дифференцирования внутри- и межвидовых форм у высших Двукрылых,  для диагностики личинок галлиц Mycodiplosis sp. не использовались.
Задачи данной работы – 1) исследовать особенности и темпы воздействия личинок галлиц Mycodiplosis sp.на спороношения ржавчинных грибов Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb. в присутствии и отсутствии микофильной инфекции; 2) сравнить по рибосомным ITS-спейсерам личинок галлиц, собранных в природе на листьях мать-и-мачехи и крестовника приречного, зараженных одним и тем же ржавчинным грибом C. tussilaginis.

А

Б

В

Рис. 1. Зависимость числа телио- и                            урединиопустул Coleosporium tussilaginis от времени питания 
личинок Mycodiplosis sp.
А – контроль 
Б – опыт с родниковой водой
В – опыт с водной вытяжкой микофила

Личинки галлиц Mycodiplosis sp. были собраны 21-26 июля 2014г. на листьях мать-и-мачехи Tussilago farfara и крестовника приречного Senecio fluviatilis с ржавчинным грибом Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb. на территории Звенигородской биостанции МГУ. В лаборатории фрагменты листьев со ржавчиной и личинками галлиц помещали на трое суток во влажные камеры (чашки Петри с фильтровальной бумагой) и 3 раза в сутки проводили учет следующих показателей - общее количество урединиопустул, общее количество телиопустул, число галлиц на фрагменте листа, количество выеденных пустул. Для каждого учёта в опытах (контрольном, с добавлением капельно-жидкой влаги, с добавлением водной вытяжки поражённых микофилом пустул) подсчитаны средние значения измеряемых показателей и средняя ошибка. Повторность – 10 чашек на каждый вариант. Общее количество личинок – 180 шт. 
Результаты эксперимента приведены на рисунке 1. На всех графиках линия, отображающая динамику числа телиопустул, является практически горизонтальной, что показывает неизменность среднего количества регистрируемых телиев в опытах и контроле. Получившаяся динамика числа урединиопустул более информативна: в контрольном опыте наблюдается явное снижение регистрируемого числа пустул с течением эксперимента. Это снижение достаточно выражено и наблюдается равномерно в течение всего опыта. В серии с добавлением на фрагмент поражённого листа капельно-жидкой воды это снижение выражено значительно более слабо. Динамика для опыта с добавлением вытяжки микофила не выражена совсем.

А

В

Б

Рис.2. Зависимость числа галлиц Mycodiplosis sp. и числа выеденных пустул Coleosporium tussilaginis от времени 
А – контроль 
Б – опыт с родниковой водой
В – опыт с водной вытяжкой микофила

Отрицательная связь между числом веденных пустул и числом питающихся личинок галлиц, представленная на рис.2, была оценена с помощью непараметрического критерия корреляции Спирмена. Результаты анализа, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что данная связь подтверждается на высоком уровне статистической значимости.

Таблица1. Корреляция числа выеденных уредопустул и числа питающихся личинок галииц Mycodiplosis puccinae по критерию Спирмана	
Вариант опыта	Объем выборки	Коэффициент корреляции Спирмана (b)	Уровень значимости	
Контроль	60	-0,52	0,000017	
Вода	60	-0,39	0,002221	
Микофилы	60	-0,61	0,000000	
Общее	180	-0,48	0,000000	
Качественная оценка закономерности изменения общего число уредопустул в ходе опыта подтверждается результатами регрессионного анализа. Он показал, что существует статистически значимая тенеденция к уменьшению общего числа урединиопустул в контроле и варианте опыта с водой. В варианте опыта с микофилами это статистически не подтверждается. Аналогично изменение среднего числа телейтоспор в ходе проведения всех серий опытов не выявлено.

Табл. 2. Изменение числа разных типов пустул в ходе опыта, оцененное с помощью коэффициента регрессии (r)
Вид пустул	Варианты опыта	Коэффициент регрессии (r)	Уровень значимости	
Уредопустулы	Контроль	-0,040	0,02	
	Вода	-0,022	0,05	
	Микофилы	-0,014	н.з.	
Телейтопустулы	Контроль	0,007	н.з.	
	Вода	-0,004	н.з	
	Микофилы	0,006	н.з	

Таким образом, проведенный эксперимент свидетельствует о том, что личинки галлиц-мицетофагов Mycodiplosis puccinae эффективно снижают численность ржавчинного фитопатогена Coleosporium tussilaginis  на расселительной урединиостадии, практически не влияя на гриб, находящийся на покоящейся телейтостадии, защищенной эпидермисом, что обеспечивает относительный баланс в системе.
ПЦР-анализ показал, что по рибосомным ITS-спейсерам личинки галлиц, собранные на мать-и-мачехе и крестовнике приречном, зараженных одним и тем же грибом Coleosporium tussilaginis (Pers.) Kleb., не отличаются, что свидетельствует в пользу представления о том, что это один и тот же вид галлицы.

Литература
Мамаев Б. М., Кривошеина Н. П. 1965. Личинки галлиц — M.: Наука. 278с.
Beckenbach, Joy, 2009. Evolution of the Mitochondrial Genomes of Gall Midges (Diptera: Cecidomyiidae): Rearrangement and Severe Truncation of tRNA Genes //Genome Biol. Evol. 1:278–287.
Nelsen D.J. A phylogenetic analysis of species diversity, specificity, and distribution of Mycodiplosis  on rust fungi // A Thesis for the degree of Master of Science in The Department of Plant Pathology and Crop Physiology. B.S., Minnesota State University, Mankato, 2010. May 2013. 152p.