ИСТИНА

Камчатский краб, лат. Paralithodes camtschaticus - членистоногое, обитающее в морях Северного Ледовитого океана и адаптированное к жизни при температурах воды близких к 0оС. Его основной пищеварительный орган, гепатопанкреас, богат психрофильными протеиназами, из него были выделены такие ферменты как трипсин, сериновая коллагенолитическая протеиназа, металлопротеиназа, эластаза, карбоксипептидаза, обладающие более высокой каталитической эффективностью (как правило, не только при 20-25°С, но и при температурах, близких к 0°С) и меньшей термостабильностью, чем их мезофильные аналоги. Позже был выделен ингибитор протеиназ, который был отнесен к классу серпинов, суперсемейству белков, обладающих оригинальным механизмом необратимого суициидального ингибирования. Белки этого класса обладают схожей третичной структурой, их масса около 40-50 кДа, они могут быть ингибиторами сериновых, реже цистеиновых протеиназ, а так же могут и не обладать ингибирующим действием (при этом быть опухолевыми супрессорами, шаперонами, переносчиками гормонов, и даже storage-белками (напр., овальбумин)). Нативный серпин камчатского краба (далее серпин PC) был исследован, его температурный оптимум лежит в интервале 15–20°C (что ниже большинства мезофильных аналогов), он стабилен в интервале 4–40°C и необратимо инактивируется при нагревании до 50°C и выше. Его ингибиторная активность проявляется в присутствии NaCl в концентрации 0,9-20%. Действие белка было исследовано in vitro на человеческие и мышиные клеточные линии. Было показано, что наличие ингибитора в клеточной культуре не влияет на адгезию клеток, но замедляет их распределение. Этот эффект дозозависимый и проявлялся не на всех исследованных клетках. Кроме того, он обладает выраженным антикоагулляционным действием. Из-за труднодоступности и сложности сырья, а так же примесей неактивного ингибитора была поставлена задача получить рекомбинантный белок для дальнейшего изучения его свойств. Была получена библиотека кДНК из тотальной мРНК гепатопанкреаса камчатского краба, в ней была найдена первичная структура, состоящая из 418 аминокислот, включая 16 аминокислот сигнального пептида. Ген был выделен методом ПРЦ, и клонирован в плазмиду pET28a для экспрессии в E.coli. Применение теплового и осмотического шока, низкотемпературной экспрессии, низких концентраций индуктора не привели к получению растворимого продукта. Искомый белок был ренатурирован из телец включения методом капельного разбавления с предварительной очисткой на ионообменной колонке с выходом 0,5 мг/л культуры. К полученным тельцам включения была получена кроличья поликлональная антисыворотка. Для увеличения эффективности и выхода целевого белка была задействована более совершенная дрожжевая система экспрессии Pichia Pastoris. Для этого был создан ряд конструкций на основе вектора pPicZ с различными сигнальными последовательностями (полной и пре-последовательности дрожжевого α-фактора спаривания, собственной последовательности), а так же трансформированы два штамма, стандартный GS115 и дефицитный по протеиназам PRB1 и PEP4 штамм PichiaPink 4.