ИСТИНА

Целью работы было: разработать систему для 3D-геномной инженерии через эктопическое привлечение фрагментов белка CTCF к заранее выбранному участку генома. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) Создать панель экспрессионных конструктов, кодирующих укороченные формы белка CTCF, слитые с белками dCas9 и EGFP. 2) Исследовать возможность создания хроматиновых петель de novo посредством привлечения различных форм химерного белка CTCF-dCas9-EGFP к заранее заданной точке генома. 3) Исследовать влияние привлечения данных химерных белков на экспрессию генов целевого локуса и его эпигенетический статус. 4) Изучить возможность восстановления исходного петлевого рисунка в линии с делецией сайта связывания CTCF через привлечение различных вариантов химерного белка CTCF-dCas9-EGFP. Методология и методы исследования: В работе были использованы современные методы молекулярной и клеточной биологии. Доставка плазмид, кодирующих химерные белки и гидовые РНК, осуществлялась электропорацией на приборе Neon, анализ пространственной организации генома выполнялся методом C-TALE, анализ профилей связывания CTCF и когезина – методами ChIP-seq и ChIP-qPCR, а анализ изменения экспрессии генов локуса - методом RNA-seq (секвенирование тотального транскриптома с обогащением целевыми последовательностями). Анализ данных о пространственной организации локуса производился с использованием программы Juicebox. Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась в помощью пакетов Hiclib, bwa, samtools, deepTools, STARRseq и featureCounts. Статистическая обработка тепловых карт контактов производилась с использованием программы LASKA. Положения, выносимые на защиту: 1) Химерный белок, в котором программируемый ДНК-связывающий модуль слит с Nконцевым доменом СTCF и двумя первыми цинковыми пальцами этого белка способен индуцировать образование хроматиновой петли между точкой его привлечения на ДНК и соседними эндогенными CBS. 2) Химерный белок из N-концевого домена и двух цинковых пальцев в отличие от более длинных химерных белков не имеет сайтов нецелевого связывания. 3) Формирование петли de novo сопровождается реорганизацией сети петлевых взаимодействий в локусе, но не вызывает активации экспрессии генов и не приводит к заметным изменениям в распределении эпигенетический метки H3K27me3 в районе привлечения петлеобразующего белка. 4) Химерный ДНК-связывающий белок на основе N-концевого домена и 2-х цинковых пальцев белка CTCF может быть использован для коррекции нарушений в петлевой структуре локуса, возникших в результате утраты эндогенного CBS.