ИСТИНА

Актуальность проблемы. Биосинтез белка на рибосомах является ключевым этапом реализации генетической информации в клетке. Этот процесс, получивший название трансляция, изучают уже более полувека. За прошедшие годы накоплен огромный объём информации о структуре как самой рибосомы, так и других молекул, необходимых для синтеза белка, исследовано взаимодействие различных компонентов аппарата трансляции, охарактеризованы все этапы прохождении функционального цикла. Значение этих работ для развития современного естествознания высоко оценивается мировым научным сообществом, в 2009 году Нобелевская премия по химии была присуждена за исследования в области изучения структуры и функции рибосом. В последнее время всё больший интерес учёных вызывают вопросы, связанные с механизмами регуляции экспрессии генов, в том числе, и ролью трансляции в этом процессе. Одним из путей, осуществляющих контроль качества белкового синтеза и регулирующих экспрессию генов на уровне трансляции в клетках прокариот, является транс-трансляция. Транс-трансляция – уникальный механизм переключения синтеза полипептидной цепи с мРНК на матричную область тмРНК, молекулы, соединяющей в себе черты матричной РНК и транспортной РНК. Транс-трансляция позволяет, с одной стороны, освободить для новых раундов трансляции рибосомы, заблокированные при трансляции мРНК без стоп-кодона, а с другой, направить на деградацию проблемную мРНК и синтезированный с неё полипептид. Активность тмРНК необходима для выживания бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды и для регуляции некоторых физиологических процессов в клетках. Молекулу тмРНК активно исследуют на протяжении многих лет. Способность тмРНК объединять в одной молекуле функции тРНК и мРНК, узнавать А-участок рибосомы без обычного кодон-антикодонового взаимодействия, переключать рибосому с повреждённой мРНК на открытую рамку считывания тмРНК, делает тмРНК интересным объектом исследований. Изучение пространственной структуры тмРНК и механизма её взаимодействия с рибосомой внесет большой вклад в понимание процесса трансляции в целом. К настоящему времени накоплен большой объём информации о процессе транс-трансляции: известны первичная и вторичная структуры тмРНК, выяснен состав системы транс-трансляции, охарактеризовано взаимодействие тмРНК с различными белковыми факторами, определена структура комплексов тмРНК с рибосомой, соответствующих начальным этапам транс-трансляции. Однако детальный механизм взаимодействия тмРНК с рибосомой неизвестен, равно как и молекулярный механизм протекания транс-трансляции. Цель работы. Понять механизм процесса транс-трансляции и создать модель его протекания. Задачи: 1. Выявить особенности взаимодействия тмРНК с белковыми партнерами – участниками транс-трансляции. 2. Охарактеризовать пространственную организацию тмРНК. 3. Установить роль отдельных элементов тмРНК в осуществлении различных этапов транс-трансляции. 4. Создать систему выделения тмРНК-рибосомных комплексов, остановленных на разных этапах транс-трансляции. 5. Исследовать выделенные комплексы тмРНК с рибосомой с помощью химических и физических подходов. 6. Предложить механизм прохождения тмРНК через рибосому в процессе транс-трансляции. Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе работы было показано существование неканонического комплекса деацилированной тмРНК с EF-Tu•GDP, в формировании которого принимают участие нуклеотидные остатки U308 спирали 2 и U268 псевдоузла 4 тмРНК. На основе результатов, полученных с помощью фотоаффинного химического сшивания и метода сайт-направленного мутагенеза, была предложена двухдоменная модель пространственной организации тмРНК, которая позволяет объяснить, как такая объёмная и высокоструктурированная молекула, содержащая 4 псевдоузла, проходит через рибосому в ходе транс-трансляции. В ходе выполнения работы была создана система, позволяющая блокировать транс-трансляцию in vivo на разных этапах прочтения ОРС тмРНК, и выделять соответствующие комплексы тмРНК с рибосомой. Использование данной системы позволило выделить комплексы, содержащие тмРНК, белок SmpB и рибосомы в стехиометрическом количестве, и доказать, что белок SmpB, который, как предполагалось ранее, необходим на стадии инициации транс-трансляции, входит также в состав элонгационного и терминационного комплексов. Методом криоэлектронной томографии была продемонстрирована конформационная подвижность петли тмРНК, состоящей из псевдоузлов, что объясняет сложности, возникающие при изучении структуры элонгационных комплексов тмРНК с рибосомой методом криоэлектронной микроскопии. Исследование спектров модификаций нуклеотидов тмРНК в различных комплексах с рибосомой с помощью метода химического пробинга показало, что структура и контакты тмРНК (за исключением мРНК-подобного домена и спирали 5) практически не изменяются в ходе транс-трансляции, что подтвердило адекватность двухдоменной модели и позволило создать динамическую модель транс-трансляции. Динамическая модель транс-трансляции позволила выявить структурный элемент (сформированный псевдоузлом 1 и петлёй А79-А86 тмРНК, и белком SmpB), который, совершая поворот при транслокации TLD тмРНК из А-участка рибосомы в Р-участок, задаёт правильное позиционирование кодона возобновления синтеза в А-участке рибосомы. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют не только фундаментальную научную ценность, но и могут быть использованы для прикладных разработок. Поскольку механизм транс-трансляции существует только в бактериальных клетках и необходим для проявления вирулентности некоторыми патогенными организмами, он представляется хорошей мишенью для синтеза новых антибиотиков, направленных на подавление активности тмРНК или белка SmpB. Известно, что активная концентрация для многих уже известных и широко используемых антибиотиков может быть существенно снижена при одновременном ингибировании транс-трансляции. Результаты работы опубликованы в виде 14 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах. Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как способ остановки транс-трансляции in vivo и метод аффинного выделения полученных комплексов, могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии, как в нашей стране, так и за рубежом. Компоненты разработанной нами системы уже были предоставлены ряду коллег из зарубежных лабораторий. Работа была поддержана грантами РФФИ, HHMI, CRDF. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции: The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark; The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июня, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия; International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа – 1 сентября, 2001, Пущино, Россия; The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 – February 1, 2002, Queenstown, New Zealand; The 6th International Conference on Ribosome Synthesis “Ribosome Synthesis 2003”, June 6-10, 2003, Arcachon, France; RNA 2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1–6, 2003, Vienna, Austria; The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия; Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, May 3-7, 2006, Roscoff, France; EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control – partnered with Cold Spring Harbor Laboratories, September 12-16, 2007, Heidelberg, Germany; Conferences Jacques-Monod Multiple functions of RNA in gene regulation, April 4-8, 2009, Roscoff, France; 34th FEBS Congress Life’s Molecular Interactions, July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic; 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Biomolecules for Quality of life, August 2-7, 2009, Shanghai, China; Ribosome 2010, May 3-7, 2010, Orvieto, Italy. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 221 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы, приложения. Материал иллюстрирован 64 рисунками, 9 таблицами и 3 приложениями. Библиографический указатель включает 226 цитированных работ.