ИСТИНА

В работе приведено комплексное исследование структуры и функциональной активности гидролитических микробных почвенных комплексов с использованием широкого набора молекулярно-биологических и классических методов, что позволило многосторонне охарактеризовать биологическую активность изучаемых экосистем. В зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов и времени сукцессии разработанная модификация флюоресцентномикроскопического метода гибридизации in situ (FISH) дала возможность оценить численность и выявить филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов вертикальных ярусов наземных экосистем. Оказалось, что численность метаболически активных клеток гидролитических комплексов составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного, наземного и почвенного ярусов биогеоценозов, определяемой окрашиванием акридиновым оранжевым. Доминировали в гидролитических комплексах, преимущественно, представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Если деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа- и бета-), то в гидролитических комплексах почв всех исследуемых типов, увеличивается доля фирмикут и актинобактерий за счет уменьшения доли протеобактерий. Таким образом, в каждом ярусе формируется специфический гидролитический прокариотический комплекс. Применение метода анализа суммарного амплификата 16S rRNA методом ДГГЭ показало существенно большее число компонентов гидролитического комплекса в образцах с добавлением полисахаридов по сравнению с контрольными (фоновыми) вариантами. Сиквенс-анализ характерных ДГГЭ полос во-первых выявил в образцах опытных микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, которые были определены флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH) и, во-вторых, позволил охарактеризовать структуру комплексов. Для образцов филлосферы обнаружено присутствие филотипов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriaceae класса Betaproteobacteria и семейству Acidobacteriaceae филлума Acidobacteria. Бактериальный компонент в наземном ярусе (для образцов подстилки ) был представлен четырьмя филотипами, составляющими два филогенетических кластера, один из которых наиболее близок к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria, второй - к семейству Clostridiaceae грамположительных бактерий. В почвенном ярусе гидролитический бактериальный компонент оказался наиболее разнообразным и включал 8 филотипов, принадлежащих к трем основным линиям эволюции бактерий: к семейству Chitinophagaceae филлума Bacteroidetes, семейству Bacillaceae грамположительных бактерий и филлуму Actinobacteria (роду Streptomyces). Функциональная активность гидролитических комплексов в исследуемых образцах почвенных микрокосмов, развивающихся при различных уровнях экологически различных параметров (влажность, температура, время сукцессии) была охарактеризована комплексом показателей, которые согласовывались между собой. Для хитинолитического комплекса зарегистрировано образование фермента хитиназы и определена динамика его концентрации в почвах, которая коррелировала с величинами эмиссии диоксида углерода и накоплением биомассы микроорганизмов в микрокосмах. При изменении экологических параметров в пределах заданных величин степень увлажненности почвы оказывается более существенным фактором для развития хитинолитического микробного комплекса (чем внесение органических веществ и время сукцессии), при этом в большей степени для деятельности хитинолитического комплекса, чем пектинолитического. Изменение влажности оказывает координирующее влияние на развитие доминантных компонентов гидролитического комплекса. Так, с увеличением влажности в хитинолитическом микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных организмов, особенно, актинобактерий. Была обнаружена новая функция актинобактерий (мицелиальных форм) в развитии гидролитического комплекса. Оказалось, что дыхание комплекса в широком диапазоне значений (влажности, поступления органического вещества, сукцессионного времени) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых определяется не столько их непосредственной гидролитической активностью, сколько вкладом в контроль функционирования микробного комплекса, по-видимому, посредством характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ, в данном случае − с регуляторной функцией. Эти результаты были подтверждены обнаружением в почвенных образцах функциональных генов. Так, методом «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров было выявлено наличие хитиназного гена (chiA) группы А (семейства гликозилгидролаз) в почвенных микробных комплексах in situ и чистых культурах микроорганизмов, изолированных из исследуемых почв. По результатам сиквенс-анализа полученных последовательностей хитиназного гена он принадлежал представителям ряда некультивируемых бактерий и филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes. Наблюдалась корреляция между результатами, полученными при исследовании филогении функционального хитиназного гена, и филогении 16S rRNA, однако среди близкородственных организмов, у которых методом ДГГЭ был выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались те, которые выделялись нами методом посева на плотные среды с хитином. Внутри домена Bacteria при оптимальных для жизнедеятельности большинства микроорганизмов условиях (влажность 60% от полной влагоемкости, температура 27оС) среди хитинолитических и пектинолитических доминантов исследуемых почв выявляются представители филумов Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры отмечается увеличение представителей филума Proteobacteria (альфа- и бета- классов), а с уменьшением влажности и возрастанием температуры в прокариотном микробном комплексе усиливается роль филума Actinobacteria, что демонстрирует регуляторную роль комбинаций экологических параметров для изменения филогенетического состава гидролитических комплексов. Таким образом, совокупность методов молекулярно-генетического анализа гидролитических прокариотных комплексов позволила пополнить перечень и отметить разнообразие микроорганизмов−гидролитиков. Полученные результаты предполагают наличие горизонтального переноса хитиназных генов, как большинства генов биодеградации, локализованных в плазмидной ДНК, внутри микробного комплекса. В приведенных исследованиях получена новая информация, интересная для понимания закономерностей стабильного существования и развития прокариотных гидролитических комплексов и важная для решения ряда почвоведческих и биотехнологических задач. Получение этой информации стало возможным благодаря применению целого комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов, модифицированных для анализа почвенных систем.