ИСТИНА

Рицин (R60) – токсин из семян клещевины – состоит из каталитической (А- или RTA) и лектиновой (В- или RTB) субъединиц. RTB связывается с клеточными рецепторами и обеспечивает эндоцитоз токсина. Активность RTA по отношению к 28S рРНК эукариот влечёт за собой необратимую остановку синтеза белка и приводит к гибели клетки [Rutenber et al., 1991]. Обязательным этапом интернализации токсинов является попадание в ранний эндосомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Показано, что из ранних эндосом незначительная часть токсина попадает в эндоплазматический ретикулум (ЭР) [Rapak et al., 1997], но это количество настолько мало, что не выявляется методами электронной микроскопии [Sandvig and van Deurs, 1996]. Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA, экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсина для транслокации в цитозоль [Венедиктова и др, 2005]. Но до настоящего времени выявить свободную RTA в клетке не удавалось. Мы предположили, что восстановление дисульфидной связи и транслокация в цитозоль происходит в ранних эндосомах. У рицина не обнаружен механизм создания пор, аналогичный таковому у дифтерийного токсина, но некоторые факты создают предпосылки возможности подобного транспорта из данного компартмента. Так, бóльшая часть интернализованного токсина находится в связанной форме с рецепторами люминальной поверхности мембраны ранних эндосом [Moisenovich et al., 2004]. Наличие гидрофобных участков способно приводить к образованию агрегатов токсинов при их высокой концентрации. Агрегаты токсина, взаимодействуя одновременно с несколькими рецепторами, могут приводить к изменениям структуры и нарушению целостности эндосомальных мембран. Гидрофобные участки белков могут взаимодействовать с мембранами и погружаться в них. Отрезок длиной в 12 аминокислотных остатков на С-конце RTA [Lamb et al., 1985], экранированный в цельном токсине, взаимодействует с бислойными мембранами лучше других гидрофобных доменов токсина. Оптимальными условиями для такого встраивания являются пониженные значения pH. В ранних эндосомах значение pH находится в таком диапазоне и составляет pH 5,5. Такому встраиванию способствует также высокий уровень содержания ненасыщенных липидов и малое количество сфинголипидов и холестерина в мембранах эндосомального компартмента, приводящий к повышенной лабильности данных мембран. Особенности функционирования эндосом приводят к постоянному отпочковыванию и слиянию везикул, что повышает вероятность нарушения целостности мембран, дестабилизированных агрегатами токсина. Т.о., выяснение концентрации рицина, взаимодействующего с люминальной поверхностью эндосомальных мембран, является принципиальным для определения возможности транслокации RTA из данного компартмента. Особый интерес к рицину и родственным ему белкам (РИБ2) вызван возможностью создавать на их основе препараты для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний. При разработке новых препаратов и совершенствовании существующих лекарственных средств на основе РИБ2 чрезвычайно важно минимизировать возможные побочные действия. В частности, необходимо учитывать тот факт, что РИБ2 являются макромолекулами и, по-видимому, могут оказывать различные воздействия на клетку-мишень. В связи с этим детальное изучение свойств разных представителей этого семейства токсинов, напрямую не связанных с ингибированием синтеза белка, представляет большой научно-практический интерес. Целью работы было изучение динамики образования свободной RTA и её накопления в органеллах клеток, предобработанных рицином. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать тест-систему для выявления свободной RTA внутри клетки. Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления RTA в клетке. Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами. 2. Определить концентрацию рицина в эндосомальном компартменте. 3. Сопоставить динамику накопления рицина в клетке с этапами её интоксикации. 4. Изучить эффекты рицина, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка. Научная новизна работы. На основе полученных моноклональных антител создана уникальная тест-система для определения свободной RTA внутри клетки. Установлено, что время, через которое в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет ≈4 часа. Показано влияние А-цепи на митогенную активность и запуск апоптоза. Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область применения токсинов в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилактидную матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.