ИСТИНА

Исследователи, занимающиеся проблемами экспрессионного клонирования в бактериях, встречаются в ходе решения поставленных вадач о рядом трудностей, мешающих успешному достижению конечной цели - получению в клетках Ошггерий препаративных количеств полноценных и биологически активных белковых продуктов чужеродных генов. К числу подобных проблем относится отсутствие в прокариотических клетках системы посттрансляциониого процесскнга мРНК, что делает невозможным получение полноценного белка - продукта эукаркотического гена, мозаичную структуру, при непосредственном введении последнего в клетки бактерий. В настоящее время существует ряд методических подходов, способствующих преодолению данной проблемы - это: 1) методы непосредственного удаления нитронов из геномных генов (путем искусственного мутагенеза или через введение геномного гена в состав ретровирусного челночного вектора); 2) химико-ферментативный синтез генов с запланированным строением, максимально приспособленным для последующей экспрессии в бактериях; 3) получение кДНК гена с помощью обратной транскрипции его мРНК. Однако вышеупомянутые методические подходы обладают рядом недостатков: трудоемкостью и дороговизной экспериментального процесса, необходимостью получения количеств ДНК гена, достаточных для последующего клонирования в составе экспрессионного вектора, а также невозможностью удаления очень протяженных интронных последовательностей (при использовании методов непосредственного деинтронирования). Разработанный в середине 80-х годов метод амплификации ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) в его приложении к задачам экспрессионного клонирования лишен недостатков, присущих вышеупомянутым методикам, и обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых прежде всего относятся быстрота проведения эксперимента, простота метода, наличие крайне малых количеств исходной матричной ДНК, на основе которой путем амплификации можно быстро получить достаточные для последующей работы количества нужного фрагмента ДНК, а также независимость метода от размеров и возможность введения в состав амплифицируемого гена необходимых регуляторных элементов для обеспечения его эффективной экспрессии в прокариотических клетках. Среда проблем, затрудняющих экспрессии чужеродных генов в бактериальных клетках существует одна, которая заключается в образовании вторичной структуры мРНК, транскрибируемой с чужеродного гена. В формирование "шпилечных" структур вовлекаются последовательности регуляторных элементов инициации трансляции, что затрудняет инициацию синтеза белка рибосомами. Данная проблема успешно решается с использованием полицистронных экепрессионных векторов, в составе которых эффективность экспрессии дистального по отношению к промотору, образованного клонированным геном, достигается в результате реализации принципа "трансляционного сопряжения" и не зависит от характера вторичной структуры мРНК. Созданная недавно векторная pPR-TGATG-І обеспечивает уровни экспрессии целевых генов за счет трансляции дистального по отношении к промотору цистрона, образуемого геном-вставкой в результате частичного перекрывания стоп-кодона (ISA) проксимального и стартового кодона (ATG) дистального цистронов.