|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Анализ пространственной организации хроматина в ооцитах мыши методом Hi-C в отдельных клеткахдипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Ульянов Сергей Владимирович, Kikue Tachibana-Konwalski
- Автор: Флямер И.М.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова, Кафедра молекулярной биологии
- Год защиты: 2015
- Аннотация: Все подходы, основанные на методе 3C, позволяют биохимическими методами определять пространственную организацию хроматина в популяции клеток. Однако очевиден принципиальный недостаток такого подхода: невозможно увидеть отличия в конформации хроматина в разных клетках, тогда как данные других методов говорят о большом разнообразии вариантов укладки в одной популяции клеток и, более того, о динамичности этой укладки в отдельно взятой клетке (Ulianov et al, 2015). Первая попытка проведения Hi-C, полногеномного варианта 3C, в единичных клетках (т.н. single-cell Hi-C) была опубликована (Nagano et al, 2013). В процедуре Hi-C стандартный протокол 3C модифицирован таким образом, что перед лигированием в липкие концы ДНК включается биотинилированный нуклеотид, с помощью которого потом на стрептавидиновых шариках отбираются фрагменты, являющиеся продуктами лигирования. Фактически, авторы указанной работы проводили обычный Hi-C, а затем отбирали отдельные ядра из взвеси, переносили в отдельные пробирки, отбирали биотинилированные фрагменты с помощью стрептавидиновых шариков, фрагментировали с помощью вторичной частощепящей рестриктазы (AluI) и готовили библиотеку для секвенирования. Однако при изучении результатов этой работы можно видеть, что полученное разрешение данных явно недостаточно для полноценного анализа пространственной организации хроматина (фактически не более 10 контактов на 1 Мб). Таким образом, необходим другой подход к адаптации метода полногеномного картирования топологии хроматина (Hi-C) к единичным клеткам для получения значительно более высокого разрешения данных. Именно в этом и состояла техническая задача настоящей работы. Очевиден интерес применения single-cell Hi-C к отдельным клеткам, которые невозможно получить в достаточном количестве для проведения обычного Hi-C. Одним из ярких примеров таких клеток являются ооциты. Из одной мыши за один раз можно выделить очень немного ооцитов – всего 10-20. Так что применение обычных биохимических методов к ним невозможно, так как они требуют как минимум многих сотен тысяч, а чаще миллионов клеток. Одновременно с этим, организация хроматина ооцитов представляет большой интерес. При помощи микроскопических исследований было выявлено множество особенностей организации ядра ооцитов (De La Fuente, 2006). Во-первых, ядро ооцитов гораздо больше, чем ядро соматических клеток — одно ядро примерно соответствует размеру целой соматической клетки, около 30 мкм. Также и ядрышко сильно увеличено в размерах по сравнению с соматическими ядрышками, его диаметр составляет порядка 10 мкм. Кроме того, в ходе последней стадии созревания ооцитов параллельно с полногеномной репрессией транскрипции происходит перестройка организации хроматина из так называемой NSN (Non Surrounded Nucleolus — не окруженное ядрышко) в так называемую SN (Surrounded Nucleolus — окруженное ядрышко). В ходе этого процесса хроматин сильно компактизуется и бóльшая его часть оказывается в кольце вокруг ядрышка. Центромеры и перицентромерный хроматин формируют особо плотный тонкий слой, непосредственно примыкающий к ядрышку и практически полностью его покрывающий. При этом рибосомальные гены оказываются вовлечены в формирование гетерохроматина и оттесняются от ядрышка. (Bonnet-Garnier et al, 2012) Ввиду невозможности получения достаточного числа клеток, ооциты исследуются почти исключительно микроскопическими методами, такими как FISH и иммунофлуоресцентное окрашивание. Для расширения арсенала методов исследования этих клеток в данной работе мы поставили следующую экспериментальную задачу: с помощью Hi-C в отдельных клетках сравнить пространственную организацию генома в NSN и SN ооцитах мыши.
- Добавил в систему: Ульянов Сергей Владимирович