Аннотация:Цель настоящей работы -- исследовать структурно-функциональные различия изоформ Tpm, уровень экспрессии которых изменяется при онкотрансформации, а также оценить влияние псевдофосфорилирования S283D изоформы Tpm2.2 на ее физико-химические свойства.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Получить молекулярно-генетическую конструкцию Tpm2.2 c мутацией, кодирующей замену S283D, необходимую для фосфорилирования изоформы Tpm2.2.
2) Получить высокоочищенные препараты белков: Tpm2.1, Tpm2.2, Tpm2.2 S283D, Tpm3.1, Tpm4.1, Tpm4.2, кофилина-1 и актина.
3) Сравнить структурные параметры изоформ Tpm методами: спектроскопии кругового дихроизма (КД), дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), регистрации светорассеяния комплексов Tpm с F-актином и ограниченного протеолиза трипсином.
4) Провести функциональные исследования изоформ Tpm: сравнить вязкость растворов изоформ Tpm, сравнить сродство изоформ Tpm к F-актину и оценить влияние различных изоформ Tpm на работу кофилина-1.
На основании проделанной работы сделаны следующие выводы:
1 Получена молекулярная-генетическая конструкция Tpm2.2 с имитацией фосфорилирования S283D.
2 Получены высокоочищенные препараты следующих белков: Tpm2.1, Tpm2.2, Tpm2.2 S283D, Tpm3.1, Tpm4.1, Tpm4.2, кофилина-1, а также актина.
3 В ходе структурных исследований было установлено, что Tpm4.2 являлась наиболее термостабильной изоформой по данным ДСК и КД и формировала самый термостабильный комплекс с F-актином среди всех изученных изоформ Tpm. Псевдофосфорилирование S283D никак не повлияло на структурные свойства молекулы Tpm2.2.
4 В ходе функциональных исследований было установлено, что вязкость растворов Tpm различалась для всех изоформ Tpm. Изоформа Tpm4.2 обладала наибольшим сродством к F-актину среди всех изученных изоформ Tpm. Tpm4.2 усиливал деполимеризацию F-актина под действием кофилина-1, а Tpm3.1 значительно увеличивал сродство кофилина-1 к актиновому филаменту. Псевдофосфорилирование S283D не приводило к изменению функциональных свойств Tpm2.2 в проведенных экспериментах.