|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Анализ особенностей и поиск ингибиторов взаимодействия белка человека Ku с ДНКдипломная работа (Специалист)
- Научный руководитель: Королев Сергей Павлович
- Автор: Павлова Евгения Ивановна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2021
- Аннотация: Человеческий белок Ku представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц: Ku70 и Ku80. Он участвует в репарации двуцепочечных разрывов ДНК путем соединения концов ДНК в местах разрывов. Помимо этого, есть множество сообщений об участии Ku в других процессах, в том числе в транскрипции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Ранее в нашей лаборатории было показано, что Ku является положительным фактором транскрипции ВИЧ-1, однако механизм этого явления изучен не был. В связи с тем, что Ku является ДНК-связывающим белком, мы предположили, что его влияние на транскрипцию может быть вызвано взаимодействием белка с вирусным LTR-промотором. Мы предложили два возможных механизма этого процесса: непосредственное взаимодействие Ku с промотором ВИЧ-1 сиквенс-специфически или за счет элементов вторичной структуры ДНК (выпетливания, шпильки, кресты); или связывание белка в месте разрыва, внесенного в промотор ДНК-топоизомеразой IIβ. Целью данной работы стало изучение особенностей взаимодействия Ku с ДНК, в частности с промотором LTR ВИЧ-1. Мы решили, что полезным инструментом для изучения возможного механизма могут являться ингибиторы взаимодействия Ku с ДНК, и разработка таких соединений стала еще одной задачей нашей работы. Необходимо отметить, что такие ингибиторы представляют интерес не только в контексте проведенных нами исследований, но также могут найти широкое применение для увеличения эффективности лучевой терапии рака, а также при проведении геномного редактирования. В ходе выполнения работы мы показали, что Ku способен взаимодействовать с LTR промотором ВИЧ при отсутствии свободных концов ДНК. Затем мы провели поиск и тестирование новых ингибиторов взаимодействия рекомбинантного белка Ku с ДНК. Был разработан новый класс синтетических ингибиторов этого взаимодействия и показано, что наиболее активное из веществ - CD14 – эффективно блокирует репарацию двуцепочечных разрывов в клетках HEK 293Т. После этого мы исследовали влияние Ku на транскрипцию гена репортерного белка люциферазы светлячка, находящегося под контролем LTR промотора ВИЧ-1 или контрольного промотора в присутствии или отсутствии CD14. Оказалось, что ингибирование взаимодействия Ku с ДНК не оказывает негативного воздействия на экспрессию люциферазы с вирусного промотора, в то время как снижение его внутриклеточной концентрации существенно понижает эффективность транскрипции. Следовательно, непосредственное взаимодействие Ku c промотором ВИЧ-1, очевидно, не является функционально значимым для участия Ku в транскрипции вируса. Мы также изучили, влияет ли снижение уровня ДНК-топоизомеразы IIβ на транскрипцию гена репортерного белка люциферазы светлячка, находящегося под контролем LTR промотора ВИЧ-1 или контрольного промотора CMV, в присутствии или в отсутствие вирусного трансактиватора Tat. В результате мы выяснили, что снижение уровня ДНК-топоизомеразы стимулирует транскрипцию вне зависимости от промотора в отсутствие Tat, а добавление трансактиватора нивелирует эффект топоизомеразы. Таким образом, мы показали, что взаимодействие Ku с ДНК не оказывает серьезного эффекта на транскрипцию ВИЧ. Мы предполагаем, что Ku может влиять на транскрипцию ВИЧ-1 за счет взаимодействия с белками – транскрипционными факторами.
- Добавил в систему: Королев Сергей Павлович