Описание:Преамбула. Курс представляет собой цикл лекций и практические занятия, в которых даны теория и практика электронно-микроскопических исследований для биологов. В лекциях даны общие сведения о принципах устройства и работы электронных микроскопов, их возможностях и перспективах использования. Рассмотрены теоретические основы методов подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением трансмиссионного и сканирующего микроскопов. Даются основы знаний необходимых для приготовления фиксирующих растворов, современные методы фиксации, пропитывания и заключения в смолы определенных, заданных параметров. На практических занятиях слушатели знакомятся с устройством ультрамикротомов, получают практические навыки по изготовлению полутонких и ультратонких срезов, знакомятся с принципами контрастирования мембран для изучения в потоке электронов, и методами окраски срезов.
В курсе даны основы знаний и практические навыки по исследованию ультраструктуры поверхности водных биологических объектов; особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Рассмотрены современные методы анализа изображений, появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями.
Самостоятельный раздел курса посвящен устройству и принципу работы конфокального микроскопа. Подробно рассматриваются методы подготовки биологического материала для изучения под конфокальным микроскопом; методы визуализации наноструктур. Даются основы иммуноцитохимии для зоологов, навыки работы с антителами. Практическая часть включает занятия на конфокальном микроскопе и методы обработки полученных результатов, 3D реконструкция, сохранение данных в разных форматах.
Даются основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой.
Студенты, завершившие изучение данной дисциплины должны:
- знать теоретические основы электронной и конфокальной микроскопии;
- познакомиться с различными типами электронных микроскопов;
- иметь представление об устройстве электронных (просвечивающие, сканирующие), световых флуоресцентных и лазерных конфокальных микроскопов;
- знать современные способы подготовки материала для различных методов микроскопии;
- иметь практические навыки подготовки материала для различных методов микроскопии;
- иметь практические навыки работы на основных типах микроскопов;
- знать основы техники безопасности при работе в химической лаборатории с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Тема 1:
Общие сведения об истории создания, принципах устройства и работы просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов (ТЭМ). Вакуумная система, электронные линзы, разрешение в ТЭМ. Астигматизм и особенности фокусировки. Новые возможности и перспективы использования в биологии.
Тема 2:
История создания и принцип работы сканирующего (растрового) электронного микроскопа (СЭМ). Разрешение и получение изображения. Астигматизм и особенности фокусировки в растровом микроскопе. Возможности и перспективы использования в биологии.
Тема 3:
Методы подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением трансмиссионного электронного микроскопа. Особенности биологических объектов. Понятие фиксации живого объекта. Нормы международного кодекса работы с животными. Общие принципы предфиксационной подготовки животных.
Тема 4:
Основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями, растворителями, ЛВЖ, летучими и токсичными веществами; безопасность при работе с электронно-микроскопической техникой.
Тема 5:
Основы знаний для приготовления буферных смесей и фиксирующих растворов, современные методы фиксации. Фиксация: цель фиксации, размеры кусочков, способы взятия ткани для фиксации. Способы фиксации: перфузия, прижизненная, биопсия. Основные параметры фиксации: выбор фиксирующих растворов, температуры, времени, необходимость использования буферных смесей, физиологических значений pH и осмомолярности.
Тема 6:
Свойства фиксаторов. Образование поперечных связей между молекулами, возникновение прочной сети связей. Особенности воздействия фиксаторов на разные группы молекул. Альдегидные фиксаторы. Четырехокись осмия. Другие фиксаторы для электронной микроскопии.
Тема 7:
Маточные растворы и разведение. Понятие молярности раствора. Концентрация раствора. Понятие осмотического давления. Расчет осмомолярности раствора. Приготовление буферных смесей и фиксаторов заданной осмомолярности.
Тема 8:
Основные принципы подготовки фиксированных объектов для исследования в высоковакуумной системе трансмиссионного электронного микроскопа. Способы дегидратации, переходные жидкости. Эпоксидные смолы, основные свойства различных смол, цель использования, условия пропитывания ткани и полимеризации.
Тема 9:
Основы знаний для исследования ультраструктуры поверхности водных биологических объектов; особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе.
Предфиксационная подготовка; методы очистки поверхности объекта; фиксация; дегидратация.
Понятие раздела сред, давления поверхностного натяжения. Знакомство с методом высушивания в критической точке. Принцип работы установки, свойства переходных жидкостей.
Тема 10:
Формирование изображения в сканирующем электронном микроскопе. Понятие электропроводности объекта. Напыление (или покрытие) объекта разными электропроводящими металлами и углеродом. Тлеющий разряд. Преимущества ионного напыления в тлеющем разряде. Способы монтировки объектов для придания электропроводности.
Тема 11:
Принципы работы ультрамикротомов; условия, необходимые для корректной работы прибора. Тримминг, полезные свойства пирамиды. Найфмекер – прибор для изготовления стеклянных ножей; особенности стеклянной режущей поверхности. Принципы изготовления полутонких и ультратонких срезов. Методы монтировки срезов. Методы контрастирования мембран для изучения в потоке электронов. Химические свойства контрастёров, основы знаний для работы с радиактивными веществами и солями тяжелых металлов.
Тема 12:
Анализ изображений, полученных при работе на трансмиссионном или сканирующем электронном микроскопе. Понятие артефакта. Виды артефактов. Условия появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями.
Тема 13:
Устройство и принцип работы конфокального микроскопа. Методы подготовки зоологического материала для изучения под конфокальным микроскопом; методы визуализации наноструктур. Понятие флуоресценции. Основные свойства флуорофоров. Спектральный диапазон; спектр поглощения или возбуждения (Excitation), спектр испускания (Emission). Автофлуоресценция.
Тема 14:
Основы иммуноцитохимии для зоологов. Основные методы окраски антигенов. Прямые методы. Непрямые (сэндвич) методы.
Теоретические основы подготовки биологического объекта для проведения иммуноцитохимической реакции. Способы фиксации, заморозки. Преинкубация: цели, задачи и методы этапа. Подготовка инкубационных растворов, разведение антител, способы хранения. Первичные и вторичные антитела: цели, задачи и методы этапа. Изготовление препаратов: среды для заключения, способы хранения.
ПРАКТИКУМ
Практическое занятие 1:
Знакомство с лабораторным оборудованием, правила поведения и работы в лаборатории микротомии; организация графика дежурств, подготовка лабораторной посуды и необходимого инвентаря. Инструкция по технике безопасности.
Практическое занятие 2:
Приготовление натрий-натриевого фосфатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с работой на электронных весах, pH-метре. Особенности подготовки посуды для хранения маточных растворов.
Практическое занятие 3:
Приготовление натрий-какодилатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с мерами предосторожности и техникой безопасности при работе с фиксаторами. Приготовление фиксатора 2.5% глутарового альдегида. Самостоятельная фиксация объектов, 1 этап.
Практическое занятие 4:
Приготовление осмиевого фиксатора: подготовка посуды для фиксатора; приготовление маточного раствора четырехокиси осмия; приготовление фиксатора четырехокиси осмия необходимой концентрации. Фиксация объектов методом двойной глутар-осмиевой фиксации.
Практическое занятие 5:
Навыки работы с высокополимерными смолами. Расчет необходимого количества готовой смолы и расчет смешиваемых компонентов для приготовления эпоксидных смол (эпон, аралдит) заданных параметров.
Дегидратация и начальный этап пропитки фиксированных объектов для ТЭМ.
Практическое занятие 6:
Самостоятельная работа с объектами. Подготовка материала для изучения на трансмиссионном электронном микроскопе (дегидратация объектов, поэтапная пропитка смолой, полимеризация).
Практическое занятие 7:
Подготовка материала для изучения на сканирующем электронном микроскопе (дегидратация, высушивание объектов в установке критической точки, самостоятельная монтировка объектов на столики, ионное напыление).
Практическое занятие 8:
Знакомство со сканирующим электронным микроскопом, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях образцов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения данных.
Практическое занятие 9:
Подготовка материала для изучения на трансмиссионном электронном микроскопе. Тримминг – подготовка блоков для резки, или как сделать пирамидку. Приготовление красителей для полутонких срезов, 1% раствор метиленовой сини для окраски эпоксидных срезов.
Практическое занятие 10:
Изготовление стеклянных ножей, анализ режущей поверхности. Обучение работе на ультрамикротомах УМТП3, LKBIII; изготовление полутонких срезов. Самостоятельная работа с объектами.
Практическое занятие 11:
Приготовление контрастёров для ультратонких срезов: 4% водного уранилацетата; 4% водного цитрата свинца.
Приготовление раствора формвара и изготовление пленочных подложек для ультратонких срезов.
Практическое занятие 12:
Обучение и самостоятельное изготовление ультратонких срезов на ультрамикротоме. Монтировка срезов на сетки и бленды с подложками. Контрастирование срезов. Самостоятельная работа с объектами.
Практическое занятие 13:
Знакомство с просвечивающим электронным микроскопом, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях срезов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения негативов и файлов.
Практическое занятие 14:
Приготовление фиксатора для иммуноцитохимических исследований. Фиксация материала для работы на конфокальном микроскопе. Основные этапы подготовки ткани для проникновения антител, подготовка растворов для преинкубации. Преинкубация.
Подготовка растворов первичных антител. Инкубирование объектов; основы знаний о первичных и вторичных антителах, навыки работы с флуорофрами.
Коньюгирование с вторичными антителами. Заключение препарата в среду с заданными светопреломляющими параметрами.
Практическое занятие 15:
Знакомство с конфокальным микроскопом, просмотр препарата в режимах флуоресцентной лампы и при сканировании лазерами; захват изображения по оси x/y; xyz; xzy.
Практическое занятие на конфокальном микроскопе. Методы обработки полученных результатов, 3D реконструкция, сохранение данных в разных форматах.
РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Гайер Г. Электронная гистохимия. Изд. “Мир”. Москва. 1974. 488 с.
Луппа Х. Основы гистохимии. М.; “Мир”. 1980. 343 с.
Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. Медицина. 1979. 151 с.
Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Изд. «Мир”. 1975 324с.
Bozzola J.J., Russell L.D. 1999. Electron Microscopy. 2nd Ed. Jones & Bartlett Pub. Inc. Sudbury. MA. 670p.
Coons A.H., Leduc E.H., Connoly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histiochemical demonstration of the specific antibody and its application to a study of the hyper immune rabbit // J. of Experimental Medicine. 1955. 102. P. 49-60.
Gustafsson M.K S. Skin the tapeworms before you stain their nervous system. A new method for whole-mount immunocitochemistry // Parasitol. Res. 1991. 77. P. 509-516.
Maunsbach A.B., Afzelius B.A. 1999. Biomedical Electron Microscopy: illustrated methods and interpretation. Academic Press. USA. 548p.
De la Torre J. G., Surgeon J.W. A methodological approach to rapid and sensitive monoamine histofluorescence using a modified glyoxylic acid technique: the SPG method // Histochem. 1975. Vol. 49. N2. P. 81-93.
Saper C. B., Sawchenko P. E. 2003. Magic peptides, magic antibodies: guidelines for appropriate controls for immunohistochemistry. The Journal of Comparative Neurology. 465:161–163.
Saper C. B. 2005. An open letter to our readers on the use of antibodies. The Journal of Comparative Neurology 493:477–478.