ИСТИНА

Цитохром с оксидаза (ЦО) – терминальное звено электрон-транспортной цепи митохондрий и дышащих бактерий, катализирует восстановление до воды молекулярного кислорода с помощью электронов, поступающих от цитохрома с согласно реакции: 4cyt2+ + O2 + 8H+ = 4cyt3+ + 2H2O + 4H+. Механизм и динамика каталитического цикла ЦО окончательно не установлены и являются предметом интенсивных исследований с использованием очень широкого круга теоретических и экспериментальных физических и химических методов. В этой ситуации большой интерес представляет исследование спектральных и кинетических характеристик ЦО в возбужденных электронных состояниях с помощью метода фемтосекундной абсорбционной спектроскопии, позволяющего отслеживать в реальном масштабе времени внутримолекулярные (внутригемовые) релаксационные процессы. Цитохром с оксидазу выделяли из сердечной мышцы быка. Во всех экспериментах концентрация составляла 50 мкМ. ЦО находилась в восстановленной дитионитом форме. В качестве буферного раствора использовался 0.05% додецил мальтозид, 0.1 М Tris-Hepes буфер pH 8 и 0.1 мМ ЭГТА. Разрешенные во времени дифференциальные спектры поглощения были измерены методом “возбуждение–зондирование”. Измерения проводились на экспериментальной установке, созданной в Институте химической физики РАН. Импульсы возбуждения с энергией 350 нДж, длительностью 23 фс и с максимумом на длине волны 600 нм фокусировали в пятно диаметром 180 мкм. Импульс белого континуума, сфокусированный в пятно диаметром 120 мкм, использовали в качестве пробного импульса. Кинетическое моделирование полученных результатов осуществлялось с помощью сингулярного разложения (SVD) матрицы данных. В результате выполненных исследований были изучены спектрально-кинетические характеристики дифференциальных спектров поглощения в спектральном диапазоне 400–500 нм и 625–700 нм при возбуждении гемов в полосу поглощения Q (600 нм) во временном интервале 80 фс–20 пс. На данном этапе исследований, несмотря на принципиальные трудности при анализе полученных экспериментальных данных, связанных с перекрывающимися спектрами поглощения гемов а и а3, нам представляется, что в изучаемом белке реализуется следующая последовательность процессов релаксации энергии фотовозбуждения. Релаксационные процессы в геме а включают в себя три стадии (рисунок): первая, длительностью короче 50 фс и вторая, более длительная ~200 фс, которая сменяется стадией длительностью ∼1 пс. После завершения процессов электронной релаксации гем а оказывается в возбужденном колебательном состоянии основного электронного состояния. Нельзя исключить, что это состояние термически неравновесное. Дальнейшая релаксация (остывание гема) длится несколько пикосекунд. Электронное возбужденное состояние с временем жизни ~200 фс мы относим к триплетному ππ*-состоянию, а состояние с временем жизни ∼1 пс – к возбужденному dd-состоянию, т.е. такому состоянию гема, когда у него d6-конфигурация иона железа находится в возбужденном состоянии. Самое короткоживущее состояние < 50 фc мы относим к синглет-синглетному ππ* поглощению из S1-возбужденного состояния гема а. В случае гема а3, несмотря на отсутствие прямых спектральных доказательств, мы полагаем, что у него имеются две первые стадии электронной релаксации, аналогичные гему а, но отсутствует длительная стадия. После завершения электронных релаксаций гем а3 также оказывается в основном электронном состоянии с избытком колебательной энергии и “остывает” в течение нескольких пикосекунд.