ИСТИНА

Ген Pou5f1 кодирует ключевой для плюрипотентных стволовых клеток транскрипционный фактор Oct-4. Вместе с Sox2 они образуют гетеродимер и регулируют транскрипцию собственных генов, а также Nanog, Fgf4, Utf1, Fbx15. Oct-4 является незаменимым при индуцировании плюрипотентности. Кроме того, нокдаун Pou5f1 ведет к дифференцировке плюрипотентных клеток. Регуляция гена Pou5f1 происходит через промотор, проксимальный энхансер и дистальный энхансер. Во время транскрипции Pou5f1, эти последовательности являются мишенями для связывания с регуляторными белками. На ранних стадиях эмбриогенеза до имплантации, а также в культивируемых эмбриональных стволовых клетках мыши ключевую роль играет дистальный энхансер, который в свою очередь имеет две важные последовательности – сайт 2А и сайт 2Б. С сайтом 2Б связывается уже описанный гетеродимер Oct-4- Sox2. При этом, точно не установлены белки-кандидаты на связывание с сайтом 2А (ССССТСССССС). В ходе наших in vitro исследований с помощью методов гель-ретардации, аффинной хроматографии и масс-спектрометрии, было выявлено несколько представителей семейства поли(Ц)-связывающих белков – hnRNPK, Pcbp1, Pcbp2. В первую очередь, они известны как РНК-связывающие белки, однако, есть данные и о транскрипционной регуляции посредством их связывания с ДНК. Была подтверждена их роль в регуляции экспрессии BRCA1 и muопиоидного рецептора. Более того, было показано, что во время нокдауна hnRNPK, падает экспрессия таких плюрипотентных маркеров, как Oct-4, Nanog и Rex1. В случае с Oct-4, это хорошо согласуется с полученными нами результатами. Мы также проверили влияние нокаута hnRNPK и Pcbp1 на экспрессию Oct-4 с помощью системы CRISPR-Cas9 на эмбриональных стволовых клетках мыши. Оказалось, что в отстутствие hnRNPK, через 4 дня снижается уровень Oct-4. При более длительном культивировании такой нокаут приводит к гибели клеток, что не связано с плюрипотентностью, т. к. такой же эффект наблюдался нами и на фибробластах линии NIH 3T3. При этом, нокаут Pcbp1 никак не отразился ни на экспрессии Oct-4, ни на жизнеспособности клеток. В настоящее время, мы работаем над подтверждением связи hnRNPK с дистальным энхансером in vivo с помощью метода хроматин-иммуннопреципитации. Финансирование исследования: Исследование поддержано грантом РНФ 17-14-01407.