ИСТИНА

Мы проверяли цитотоксичность четырех образцов наночастиц магнетита (нанокубы 15 нм, нанокластеры 40 нм, наностержни 20 нм и наночастицы магнетита, допированные гадолинием 15 нм, покрытые Pluronic-F127) на культурах клеток рака молочной железы мыши (клеточная линия 4T1) и меланомы мыши (B16) стандартным MTS-тестом. Перед внесением теста, после отмывки от растворов наночастиц, мы также фотографировали монослой клеток в лунках на световом микроскопе, чтобы оценить их внешнюю морфологию, и дополнительно в ряде случаев оценивали витальность клеток с помощью окраски трипановым синим. Мы рассаживали примерно по 8000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Дав клеткам осесть на дно лунки в течение суток, далее мы вносили наночастицы в DPBS (1:1 раствор частиц к питательной среде, таким образом, среда была разбавлена в два раза во всех лунках, в т.ч. и в контрольных, куда был добавлен просто DPBS без частиц). MTS-тесты показали, что нанокубы и наночастицы с гадолинием ток-сичны для клеток 4T1 и B16, в то время как нанокластеры и наностежни – нет. Инкубация с нанокубами в течение 24 или 48 часов дала сходные ре-зультаты MTS-тестов, поэтому мы можем заключить, что цитотоксичное действие этих наночастиц начинается сразу вскоре после начала инкубации. Нанокластеры же практически не вызвали гибель клеток как после 24 ч, так и после 48 ч инкубации. На фотографиях клеток со светового микроскопа видно, что после инкубации при больших концентрациях нанокубов (15-250 мкг/мл, здесь и везде далее приводятся концентрации по магнетиту) и частиц с гадолинием (9-70 мкг/мл) клетки действительно мертвы. При концентрации нанокубов 250 мкг/мл они полностью заполняют цитоплазму клеток, набивают ее, но не проникают в ядро, мертвая клетка сохраняет очертания живой распластанной клетки с отростками. При концентрациях кубов 31–125 мкг/мл мертвые клетки 4T1 имеют округлую форму. При концентрации 15 мкг/мл также заметны тяжи между тоже шаровидными клетками, т.е. еще сохраняются следы связей клеток в разрушенном монослое. При 7 мкг/мл мертвые клетки также обнаруживаются, но встречаются и живые клетки с большим количеством зерен в цитоплазме (скорее всего, это скопления наночастиц). При 3,5 мкг/мл и менее клетки очень похожи на клетки в контрольных лунка, где частиц не добавляли. Токсичный эффект нанокубов заметен уже в первые минуты после добавления их к клеткам, при этом pH образца был нейтральным. Окраска трипановым синим клеток после инкубации с нанокубами показала, что ок-расились именно шаровидные клетки, что говорит о том, что их мембрана проницаема и они мертвы. Наночастицы с гадолинием также оказались цитотоксичными, причем в еще меньших концентрациях, чем нанокубы (начиная с 9 мг/мл для частиц с гадолинием – и с 30 мг/мл – для нанокубов). Для концентраций 9–70 мкг/мл наночастиц с гадолинием микрофотографии клеток не показывают резкого изменения в их морфологии, как мы заметили для высоких концентраций нанокубов, однако клетки выглядят все же мертвыми, не распластанными. В ядрах мертвых этих клеток по сравнению с контролем очень хорошо заметны ядрышки, они словно дополнительно отконтрастированы. Форма клеток немного более округлая, чем в контроле. По графику выживаемости после инкубации с наночастицами с гадолинием по результатам MTS-теста резкий переход заметен между концентрациями 8,8 и 4,4 мкг/мл. При микроскопии видно, что после 4,4 мг/мл клетки растут монослоем, но расстояния между соседними клетками уже слегка увеличены по сравнению с контролем, а при 8,8 мг/мл – ядрышки сильно уже заметнее, чем при меньших концентрациях этих наночастиц. Таким образом, оценка морфологического состояния клеток после инкубации с наночастицами с помощью световой микроскопии хорошо согласуется с результатами MTS-теста на цитотоксичность образцов наночастиц магнетита. Работа выполнена в рамках проекта Минобрнауки России (14.607.21.0132, RFMEFI60715X0132).