ИСТИНА

В данной работе представлен гомогенный метод определения ионов ртути с применением метода аллостерической активации пероксидаза-подобного ДНКзима (ППДНКзим). Метод аллостерической активации предполагает использование двух олигонуклеотидных последовательностей. Зонд 1 представляет собой нековалентный комплекс гемина и его аптамера EAD2 (ППДНКзим) с ассоциированной олигонуклеотидной последовательностью, которая комплементарна зонду 2. Пробы взаимодействуют друг с другом с образованием ДНК-дуплекса, в результате чего повышается каталитическая активность ППДНКзима [1]. Если в последовательностях, формирующих ДНК-дуплекс, заменить некоторые нуклеотиды на тимины (Т) так, чтобы Т зонда 1 находился напротив Т зонда 2, нарушение комплементарности приведет к снижению энергии взаимодействия зондов 1 и 2 и, следовательно, снижению каталитической активности ДНКзима. Ранее было показано, что ионы ртути Hg2+ могут стабилизировать дуплексы, за счет формирования связей T–Hg2+–T [2]. В этом случае добавление ионов ртути к зондам 1 и 2, содержащим Т-Т пары, должно приводить к формированию стабильного ДНК дуплекса и повышению каталитической активности ППДНКзима. Для проверки этой гипотезы были исследованы взаимодействия трех различных пар зондов 1 и 2 в присутствии и отсутствии ионов ртути. Для определения каталитической активность ППДНКзима в качестве субстратной смеси использовали люминол и Н202. Полученные результаты подтвердили, что активность зонда 1 повышается при добавлении катионов ртути в реакционную смесь, содержащую зонда 1 и 2. Было продемонстрировано, что наилучшими аналитическими параметрами обладают зонда 1 с последовательностью 5’-TCG-TTT-CTC-TCT-CCA-ACT-GGG-AGG-GAG-GGA-GGG-A-3’ и проба 2 - 5’-TTG-GTT-TGA-GAA-ACG-A-3’. После проведения оптимизации реакционных условия (концентрации зондов 1 и 2 и концентрация гемина) были получены следующие аналитические параметры: предел обнаружения и линейный диапазон составили 12 нМ и 12-600 нМ, соответственно. А коэффициент вариации, определяемый в рабочем диапазоне, составил 0,7 – 3%, что говорит о высокой точности предлагаемого метода. Для оценки специфичности разработанного метода был проведен анализ с добавлением в реакционную смесь различных катионов металлов (Hg2+, Ag+, Pb2+, Ca2+, Zn2+, Bi3+, Ni2+, Co2+, Ba2+, Mn2+, Cd2+, Mg2+ и Cr3+). Установлено, что только катионы ртути в наномолярных концентрациях повышают каталитическую активность ППДНКзима. Добавление ионов кобальта в реакционную смесь приводило к повышению каталитической активности ДНКзима при концентрации Co2+, равной 3 мкМ и выше. При добавлении других катионов металлов каталитическая активность зонда 1 не изменялась, что говорит о высокой специфичности разработанного метода. Мы благодарим Российский Научный Фонд за финансовую поддержку (17-14-01042). Ссылки: 1. A. V. Gribas, S. Zhao, I. Yu. Sakharov, RSC Adv, 2015, 5, 82865-82868. 2. A. Ono, H. Togashi, Angew. Chem., Int. Ed., 2004, 43, 4300–4302.